生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法

生产o-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及：多肽；表达该多肽的生产O?琥珀酰高丝氨酸的微生物；和通过使用其生产O?琥珀酰高丝氨酸的方法，所述多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸O?琥珀酰转移酶活性。KCCM11433P20130620
【专利说明】
生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物和通过使用其生产O-琥珀酰 高丝氨酸的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及分离的多肽、表达该多肽的微生物和使用其生产〇-琥珀酰高丝氨酸的 方法，所述分离的多肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶 活性。
【背景技术】
[0002] 已知自然界中存在的大多数微生物利用0-琥珀酰高丝氨酸或0-乙酰高丝氨酸作 为中间体用于生物合成甲硫氨酸。一般而言，由将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基缀合至高丝氨酸 的高丝氨酸0-琥珀酰转移酶(Me tA)生产0-琥珀酰高丝氨酸，并且由将乙酰辅酶A的乙酰基 缀合至高丝氨酸的高丝氨酸〇-乙酰转移酶(MetX)生产0-乙酰高丝氨酸。即，在中间体间生 产〇-琥珀酰高丝氨酸中，metA在生产其的微生物的发育中是最重要的基因之一。同时，与 MetA不同，MetX已知为没有被反馈抑制并且具有高的酶稳定性。
[0003] 可以使用具有metB基因缺失的菌株生产0-琥珀酰高丝氨酸，所述metB基因编码甲 硫氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ合成酶。然而，产〇-琥珀酰高丝氨酸菌株需要L-甲硫氨 酸。为此，高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶的活性通过经历添加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制 而被抑制，并且最终，不能获得高浓度的〇-琥珀酰高丝氨酸。
[0004] 因此，许多在先专利已经将它们的研究集中于从反馈控制系统解除metA的反馈抑 制。然而，由metA编码的高丝氨酸0-琥珀酰转移酶具有问题，因为野生型蛋白本身具有低的 稳定性并且为了解除反馈抑制引入突变加剧不稳定性。因此，对于具有高生产力的产〇-琥 珀酰高丝氨酸的菌株的开发而言，去除metA基因的反馈抑制并且确保酶稳定性是必需的。

【发明内容】

[0005] [技术问题]
[0006] 为了解决上面描述的metA的反馈抑制的现象和酶不稳定性问题，本发明人已经努 力开发了具有稳固的酶稳定性同时不受甲硫氨酸反馈抑制的高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶，并 且就这一点而言，已经筛选了具有活性的新型的酶。作为选择如此筛选的候选基因并在将 它们引入埃希氏杆菌属(Escherichia)某种之后在烧瓶中培养的结果，本发明人已经发现 了 〇-琥珀酰高丝氨酸的生产，并且发现了如此选择的基因具有高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶活 性和对甲硫氨酸的反馈抑制的抗性，从而完成本发明。
[0007] [技术方案]
[0008] 本发明的目标是提供新型的分离的多肽，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且 具有高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性。
[0009] 本发明的另一个目标是提供编码该新型的分离的多肽的多核苷酸。
[0010] 本发明的进一步的目标是提供生产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其表达该新型的 分离的多肽。
[0011] 本发明的进一步的目标是提供使用上面的微生物生产ο-琥珀酰高丝氨酸的方法。
[0012] [发明的有益效果]
[0013] 生产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物一一其包括新型的分离的多肽，该多肽对甲硫氨 酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶活性一一可以对甲硫氨酸的反 馈抑制具有抗性并且以高产量生产〇-琥珀酰高丝氨酸，并且因而可以有效地用于以高产量 生产L-甲硫氨酸，其使用0-琥珀酰高丝氨酸作为前体。
[0014] [实施本发明的最佳模式]
[0015] 为了实现上面的目标，在一方面，本发明提供了对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性 并且具有高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性的新型的分离的多肽。
[0016] 如本文所使用的，术语"高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性"指的是在甲硫氨酸生物合 成期间将高丝氨酸转化为〇-琥珀酰高丝氨酸的活性。
[0017] 如本文所使用的，术语"反馈抑制"指的是在甲硫氨酸生物合成期间高丝氨酸0-琥 珀酰转移酶的活性受甲硫氨酸的抑制。
[0018] 本发明的多肽的特征在于其具有SEQ ID N0:29的氨基酸序列，该氨基酸序列具有 高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性，并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。与上述多肽共享 80 %或更多，特别地90 %或更多，更特别地95 %或更多，和甚至更特别地97%或更多的序列 同源性的任何多肽也在本发明的范围内，只要如本发明中建议的，该多肽具有高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶活性并且对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性。同源性可以使用BLAST-一其是 参考算法--测定，或者使用Pearson的FASTA测定[Methods Enzymol ·，183，63( 1990)，下 文]。基于BLAST算法，已经开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[www. ncbi . nlm. nih. gov，下 文]。
[0019] 在另一方面，本发明提供了编码上述多肽的分离的多核苷酸。具体而言，多肽可以 由SEQ ID N0:36的多核苷酸序列编码，由于密码子简并性，与上述序列具有至少80%，特别 地90%或更多，更特别地95%或更多，和甚至更特别地97%或更多的序列同源性的那些多 核苷酸也在本发明的范围内，但是不限于此。
[0020] 在仍另一方面，本发明提供了以可操作方式包括该多核苷酸的载体。
[0021] 如本文所使用的，术语"载体"指的是包括编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的核苷 酸序列的DNA构建体，其中感兴趣的蛋白质可操作地连接至适合的调控序列，使得感兴趣的 蛋白质可以在适合的宿主中表达。调控序列可以包括能够起始转录的启动子、用于调控转 录的任何操纵基因序列、编码适合的mRNA核糖体结合结构域的序列、和调控转录和翻译终 止的序列。载体在转化入适合的宿主之后，可以独立于宿主基因组复制或起作用，或者可以 整合入宿主基因组本身。
[0022] 本发明中使用的载体可不被具体地限制，只要载体在宿主中是可复制的，并且可 以使用本领域中已知的任何载体。
[0023] 在仍另一方面，本发明提供了表达多肽的产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物，所述多 肽对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶活性。
[0024] 如本文所使用的，术语"产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物"可以指可以生产0-琥珀酰 高丝氨酸并且在细胞内和细胞外储存它的微生物。
[0025] 生产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物包括原核和真核微生物菌株，例如，属于埃希氏 杆菌属、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属（genus Serratia)、普罗维登斯菌属 (genus Providencia)、棒状杆菌属（genus Corynebacterium)和短杆菌属（genus Brevibacter ium)的微生物菌株，但不限于此。具体而言，微生物可以是属于埃希氏杆菌属 的微生物，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0026]可以使用生产L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的微生物菌株，和特别地使用产 L-苏氨酸的菌株制备产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物。由于产L-苏氨酸的菌株是能够合成作 为0-琥珀酰高丝氨酸的前体的L-苏氨酸和高丝氨酸的菌株，因此大量的甲硫氨酸前体，即 〇-琥珀酰高丝氨酸，可以使用该菌株合成。
[0027] 在本发明中，多肽的表达可以通过以可操作方式转化有包含编码该多肽的基因的 重组载体或者通过将编码该多肽的多核苷酸插入染色体实现，但是方法不限于此。
[0028] 如本文所使用的，术语"转化"指的是以下过程:将包括编码靶蛋白的多核苷酸的 载体引入宿主细胞，从而能够实现由多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。对于转化 的多核苷酸而言，它是否插入宿主细胞的染色体并且位于其中或者位于染色体的外面是无 所谓的，只要它可以在宿主细胞中表达。多核苷酸可以以任何形式插入，只要它可以被引入 宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是 包括自主表达所需要的所有必需元件的多核苷酸构建体。表达盒可以常规地包括可操作地 连接至基因的开放阅读框（"0RF"，下文）的启动子、转录中止信号、核糖体结合结构域和翻 译中止信号。本发明中使用的启动子可以不被具体地限制，只要它可以以高频率起始在宿 主细胞中编码靶蛋白的多核苷酸的转录，并且可以使用本领域中已知的任何启动子。特别 地，可以使用T7启动子、trc启动子、tac启动子和CJl启动子(韩国专利号0620092)等。
[0029] 在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码胱硫醚γ合 成酶的metB基因。
[0030] 在本发明的示例性实施方式中，可以进一步缺失或减弱微生物中编码高丝氨酸激 酶的thrB基因和编码高丝氨酸0-琥珀酰转移酶的metA基因。
[0031] 额外地，在示例性实施方式中，微生物可以是埃希氏杆菌属某种，其中磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶被进一步增强。
[0032] 在本发明中，基因的序列可以从数据库获得，比如美国国家生物技术信息中心 (NCBI)0
[0033] 如本文所使用的，术语"缺失"指的是在染色体内从对应于起始密码子的核苷酸序 列到对应于终止密码子的核苷酸序列去除靶基因的核苷酸序列区域的一部分或全部的类 型，或者去除其调控区域的核苷酸序列区域的一部分或全部的类型。
[0034]如本文所使用的，术语"减弱"指的是去除或降低微生物菌株中由对应的多核苷酸 编码的至少一种酶的细胞内活性。例如，可以通过修饰基因的表达调控序列或5'_UTR的核 苷酸序列减弱蛋白质的表达，或者可以通过在对应基因的ORF区中替换起始密码子或引入 突变减弱蛋白质的活性。
[0035] 如本文所使用的，术语"增强"指的是增加由对应的多核苷酸编码的酶的细胞内活 性。可以通过基因的过表达或通过引入多核苷酸序列自身的修饰实现酶的细胞内活性的增 强。
[0036] 多核苷酸的过表达可以是通过替换表达调控序列的修饰或通过突变、替换起始密 码子、将多核苷酸额外地插入染色体或通过使用载体的引入增加拷贝数的修饰、或其组合。
[0037] 表达调控序列是控制可操作地连接至其的多核苷酸的表达的序列，例如，启动子、 终止子、增强子、沉默子、SD序列等。由TTG或GTG组成的起始密码子可以替换为ATG以增加对 应基因的酶活性，或者通过以相反方式替换降低对应基因的酶活性。多核苷酸可以是通过 插入染色体内的特定位点而具有增加的拷贝数的多核苷酸。特定位点可以包括，例如，转座 子或基因区间。额外地，多核苷酸可以是被插入表达载体的多核苷酸，该表达载体又被引入 宿主细胞，从而具有增加的拷贝数。
[0038] 在另一方面，本发明提供了生产0-琥珀酰高丝氨酸的方法，其包括在培养基中培 养上述微生物以生产〇-琥珀酰高丝氨酸，和从微生物或培养基中获得〇-琥珀酰高丝氨酸。 [0039]培养上面制备的生产0-琥珀酰高丝氨酸的微生物菌株可以根据本领域中已知的 适合的培养基或培养条件进行。培养方法可以容易地由本领域普通技术人员根据待选择的 菌株调节以便使用。特别地，培养可以是分批培养、连续培养和补料培养，但不限于此。例 如，在参考文南犬（Jame s M.Lee, aBiochemical Engineering"，Prentice-Hal 1 International Editions,pp 138-176)中公开了这些不同的培养方法。
[0040] 用于培养的培养基必须适当地满足具体菌株的要求。例如，参考文献(American Society for Bacteriology，"Manual of Methods for General Bacteriology"， Washington D.C.，USA，1981)中公开了用于不同微生物的培养基的实例。培养基可以包含 各种碳源、氮源和痕量元素。培养基中包含的碳源的实例可以包括糖类，比如葡萄糖、蔗糖、 乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素;脂肪，比如豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油;脂肪酸，比如 软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，比如甘油和乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些碳源可以单独 或组合使用。培养基中包含的氮源的实例可以包括有机氮源，比如蛋白胨、酵母提取物、肉 汁(meat gravy)、麦芽提取物、玉米楽;(CSL)和豆粉;和无机氮源，比如脲、硫酸铵、氯化铵、 磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独或组合使用。作为磷源，培养基可以包含磷酸 二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。另外，培养基可以包含金属，比如硫酸镁和硫酸铁。而 且，可以包含氨基酸、维生素和适合的前体等。这些培养基或前体可以以分批培养或连续培 养的形式加入到培养基中。
[0041] 另外，培养基的pH可以通过在培养期间以适合的方式添加化合物来调节，所述化 合物比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸。另外，在培养期间可以使用消泡剂比如脂肪 酸聚乙二醇酯防止气泡形成。另外，可以将氧气或含有氧气的气体(例如空气)加入到培养 基中以维持培养中的需氧条件。培养温度可以在20°C到45 °C的范围内，并且特别地25°C到 40°C的范围内。可以继续培养直到获得期望量的0-琥珀酰高丝氨酸产物，并且特别地持续 10小时到160小时。
[0042] 由本发明的方法生产的0-琥珀酰高丝氨酸可以通过胱硫醚γ合成酶或者0-琥珀 酰高丝氨酸硫化氢解酶转化为甲硫氨酸。另外，通过将本发明的方法生产的0-琥珀酰-L-高 丝氨酸与CH 3SH反应，除了 L-甲硫氨酸之外，还可以获得副产物琥珀酸。
[0043]在仍另一方面，本发明涉及对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性的多肽的用途，其中该多肽具有SEQ ID Ν0:29的氨基酸序列。本发明的 新型的分离的多肽确认为对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且能够以高产量生产0-琥珀 酰高丝氨酸，并且因而该多肽可用于生产0-琥珀酰高丝氨酸。
【具体实施方式】
[0044]在下文中，将参照下面的实施例对本发明进行更详细地描述。但是这些实施例仅 出于说明性的目的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
[0045] 实施例1:基于产苏氨酸的菌株的亲株的制备
[0046] (l)metB基因的缺失
[0047]为了表征metX基因的底物特异性和活性，菌株可以积聚高丝氨酸并且具有利用酰 基高丝氨酸的缺失。该菌株基于FTR2533(KCCM 10541)--在国际专利公布号WO 05/ 075625中公开的产苏氨酸的菌株一一构建。
[0048] 通过FRT--步-PCR缺失方法(PNAS(2000)vol 97:P 6640-6645)缺失产苏氨酸的 菌株--FTR2533(KCCM 10541)菌株--中的编码胱硫醚合成酶的metB基因。通过PCR使用 SEQIDN0:l和SEQIDN0:2的引物，以及pKD3载体(PNAS(2000)vol97:P 6640-6645)作为 模板构建缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环:在94 °C下变性30s、在55°C下退火30s和 在72 °C下聚合Imin。
[0049] <SEQ ID N0:1>
[0050] 5'ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg gagctgcttc 3?
[0051] <SEQ ID N0:2>
[0052] 5? ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata tcctccttag 3?
[0053] 得到的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.2kbpDNA带。回 收的DNA片段电穿孔入FTR2533菌株，其已经转化有pKD46载体
[0054] 为了电穿孔，转化有pKD46载体的FTR2533菌株在含有100yg/L的氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中在30 °C下培养，直到0D600达到0.6。生成物使用无菌蒸馏水洗涤 两次，并且然后使用10%甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2500V下进行。
[0055]将回收的菌株平板接种在含有25yg/L氯霉素的LB平板培养基上，37°C下培养过 夜，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。选择的菌株使用相同的引物同时使用菌株作为模 板经历PCR，并且通过观察到在1.0 %琼脂糖凝胶中存在1.2kb的基因带确认metB基因的缺 失。将如此确认的菌株又转化有PCP20载体(PNAS (2000) vo 1 97: P6640-6645)并且在LB培养 基中培养，并且具有150bp的减小大小的me tB基因缺失的最终菌株一一其在1.0 %琼脂糖凝 胶中确认一一又通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯霉素标记从菌株中去除。 如此构建的菌株命名为"CJMA1"。
[0056] (2)thrB基因的缺失
[0057]如metB基因缺失的情况一样，使用FRT--步-PCR缺失方法在如此构建的CJMAl菌 株中缺失编码高丝氨酸激酶的thrB基因。
[0058]通过PCR使用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的引物，以及pKD4载体(PNAS(2000)vol 97 :P 6640-6645)作为模板构建thrB缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环：在94°C下变 性30s、在55°C下退火30s和在72°C下延伸lmin。
[0059] <SEQ ID N0:3>
[0060] aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg gtgtaggctg gagctgcttc
[0061] <SEQ ID N0:4>
[0062] agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg ggaaggcaaa catatgaata tcctccttag
[0063] 得到的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.6kbpDNA带。回 收的DNA片段电穿孔入CJMAl菌株，其已经转化有pKD46。将回收的菌株平板接种在含有50μ g/L卡那霉素的LB平板培养基上，37°C下培养过夜，并且选择对卡那霉素显示抗性的菌株。 选择的菌株使用SEQ ID N0:3和4的引物在相同的条件下经历PCR，并且通过观察到在1.0% 琼脂糖凝胶中存在1.6kb的基因带确认thrB基因的缺失。将如此确认的菌株又转化有pCP20 载体并且在LB培养基中培养，并且具有150bp的减小大小的thrB基因缺失的最终菌株一一 其在1.0%琼脂糖凝胶中确认一一又通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了卡那霉 素标记从菌株中去除。如此构建的菌株命名为"CJMA2"。
[0064] (3)metA基因的缺失
[0065] 为了表征在CJMA2菌株中源自青紫色素杆菌（Chromobacterium Violaceum)的 metX基因的底物特异性和活性，基于CJMA2菌株使染色体上的原始metA基因缺失，其中在 FTR2533(KCCM 10541)菌株中，metB和thrB基因被缺失。通过FRT--步-PCR缺失方法使metA 基因缺失。
[0066] 通过PCR使用SEQ ID N0:5和6的引物，以及pKD3载体（PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板构建me tA缺失盒。PCR在下列条件下进行30个循环:在94 °C下变性30s、在55 °C下退火30s和在72 °C下延伸Imin。
[0067] <SEQ ID N0:5>
[0068] caatttcttg cgtgaagaaa acgtctttgt gatgacaact tctcgtgcgt gtgtaggctg gagctgcttc
[0069] <SEQ ID N0:6>
[0070] aatccagcgt tggattcatg tgccgtagat cgtatggcgt gatctggtag catatgaata tcctccttag
[0071] 得到的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，并且纯化从其获得的1.2kbpDNA带。回 收的DNA片段电穿孔入CJMA2菌株，其已经转化有pKD46。将回收的菌株平板接种在含有氯霉 素的LB平板培养基上，37°C下培养过夜，并且选择对氯霉素显示抗性的菌株。
[0072]选择的菌株使用SEQ ID N0:5和6的引物在相同的条件下经历PCR，并且通过观察 到在1.0%琼脂糖凝胶中存在I. Ikb的基因带确认metA基因的缺失。如此确认的菌株又转化 有PCP20载体并且在LB培养基中培养，并且具有IOObp的减小大小的thrB基因缺失的最终菌 株一一其在1.0%琼脂糖凝胶中确认一一通过在相同的条件下进行PCR构建，并且确认了氯 霉素标记从菌株中去除。如此构建的菌株命名为"CJM2"。
[0073] CJM2菌株可以在菌株中积聚过量的高丝氨酸，并且可以根据被引入的质粒的metX 底物特异性生产〇-乙酰高丝氨酸或〇-琥珀酰高丝氨酸。
[0074] 实施例2:选择具有新型0-琥珀酰转移酶活性的多肽
[0075 ] 为了确保me t A基因的反馈控制的解除和稳定性，在KEGG网站(//www .genome.jp/ kegg/)中选择命名为metX的10种类型的直向同源物，并且将其克隆入pCL1920_PCJl载体。 将实施例1中制备的CJM2菌株转化有10种不同类型的载体。
[0076]如此获得的10种不同种类的菌株经历使用在下面的实施例5_(2)中描述的烧瓶培 养方法的烧瓶评价。CJM2是可以积聚高丝氨酸的菌株。当将高丝氨酸琥珀酰转移酶基因引 入PCL1920时，0-琥珀酰高丝氨酸可以作为终产物获得，然而当将高丝氨酸乙酰转移酶基因 引入pCL1920时，〇-乙酰尚丝氨酸可以作为终广物获得。就这一点而目，基因 其为编码 高丝氨酸琥珀酰转移酶的metX基因一一在已经评价的10种不同类型中获得。基因是青紫色 素杆菌源的metX基因，其具有以高产量生产0-琥珀酰高丝氨酸的特性(SEQ ID NO: 29的氨 基酸序列，和SEQ ID N0:36的核苷酸序列），并且本发明人已经确认上述活性是先前从未报 道过的新型活性。
[0077] 实施例3:质粒构建
[0078] 3-1.表达源自野生型大肠杆菌的metA基因的质粒的构建
[0079] 使用购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection) (ATCC)的大 肠杆菌W3110(登录号:ATCC 9637)的染色体作为模板，连同SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的 引物进行PCR，以扩增编码高丝氨酸0-琥珀酰转移酶的metA基因。
[0080] PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health)的GenBank(NIH GenBank)中登记的大肠杆菌染色体(NC_000913)的核苷酸序列制 备的，并且SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的引物分别具有EcoRV限制酶切位点和HindIII限制 酶切位点。
[0081] <SEQ ID N0:7>
[0082] 5 ' AATTGATATCATGCCGATTCGTGTGCCGG 3 '
[0083] 〈SEQ ID NO:8>
[0084] 5'AATTAAGCTTTTMTCCAGCGTTGGATTCATGTG 3'
[0085] PCR通过在94°C下变性3min;在94°C下变性30s、在56°C下退火30s和在68°C下聚合 2min，30个循环;和在68 °C下聚合IOmin进行。
[0086] 在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJl启动子 (韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5a，并且通过从含 有壮观霉素 (50yg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5a来获得质粒。如此获得的质粒命 名为pCL_Pcjl_metA(wt)。
[0087] 3-2.表达具有反馈抗性的metA基因的质粒的构建
[0088]基于作为模板的在实施例3-1中制备的pCL_PCjl_metA(Wt)，使用定点诱变试剂盒 (Stratagene，USA)构建对甲硫氨酸具有反馈抗性的metA基因 (metA#l 1)。
[0089] 具体而言，根据国际专利公布号WO 2008/127240中的公开内容，使用SEQ ID N0:9 和SEQ ID NO: 10的引物，将第29位氨基酸--丝氨酸--替换为脯氨酸（S29P);使用SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12的引物，将第114位氨基酸--谷氨酸--替换为甘氨酸 (E114G);并且使用SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的引物，将第140位氨基酸--苯丙氨 酸一一替换为丝氨酸(F140S)。使用的引物的核苷酸序列如下显示。
[0090] <SEQ ID N0:9>
[0091] 5'ATGACAACTTCTCGTGCGCCTGGTCAGGAAATTCG 3'
[0092] <SEQ ID N0:10>
[0093] 5'CGAATTTCCTGACCAGGCGCACGAGAAGTTGTCAT 3'
[0094] <SEQ ID N0:11>
[0095] 5'CGCCGCTGGGCCTGGTGGGGTTTAATGATGTCGCT 3'
[0096] <SEQ ID N0:12>
[0097] 5，AGCGACATCATTAAACCCCACCAGGCCCAGCGGCG 3，
[0098] <SEQ ID N0:13>
[0099] 5'CACGTCACCTCGACGCTGAGTGTCTGCTGGGCGGT 3'
[0100] <SEQ ID N0:14>
[0101] 5'ACCGCCCAGCAGACACTCAGCGTCGAGGTGACGTG 3'
[0102] 包含metA( #11)基因的质粒--其通过连续引入而引入有全部三个种类的修 饰--被构建并且命名为口〇^3(^1_11^^4#11。
[0103] 3-3.表达源自耐福射球菌(Deinococcus radiodurans)的metX基因的质粒的构建
[0104]使用购自美国菌种保藏中心(ATCC)的耐辐射球菌(登录号:ATCCBAA-816D)的染色 体作为模板，连同SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16的引物进行PCR，以扩增编码高丝氨酸0-乙 酰转移酶的metX基因。
[0105] PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)中登记 的染色体(AE000513)的核苷酸序列制备的，并且SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16的引物分别 具有EcoRV限制酶切位点和Hind III限制酶切位点。
[0106] <SEQ ID N0:15>
[0107] 5'AATTGATATCATGACCGCCGTGCTCGC 3'
[0108] <SEQ ID N0:16>
[0109] 5'AATTAAGCTTTCAACTCCTGAGAAACGCCCC 3'
[0110] PCR通过在94 °C下变性3min;在94 °C下变性30s、在56 °C下退火30s和在68 °C下聚合 5min，30个循环;和在68 °C下聚合7min进行。
[0111] 在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJl启动子 (韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5a，并且通过从含 有壮观霉素(50yg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5a来获得质粒。如此获得的质粒命 名为pCL_Pcjl_dra metX〇
[0112] 3-4.表达源自青紫色素杆菌的me tX基因的质粒的构建
[0113]使用购自美国菌种保藏中心(ATCC)的青紫色素杆菌(登录号:ATCC 12472)的染色 体作为模板，连同SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的引物进行PCR，以扩增源自青紫色素杆菌 的metX基因。
[0114] PCR中使用的引物是基于在美国国立卫生研究院的GenBank(NIH GenBank)中登记 的青紫色素杆菌染色体(NC_005085)的核苷酸序列制备的，并且SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的引物分别具有EcoRV限制酶切位点和Hind III限制酶切位点。
[0115] <SEQ ID N0:17>
[0116] 5'aatt gatatc ATGACCGACACCAACTGTTCGG 3'
[0117] <SEQ ID N0:18>
[0118] 5'aatt aagctt TCATGCGTTCACCTCCTTGGC 3'
[0119] PCR通过在94°C下变性3min;在94°C下变性30s、在56°C下退火30s和在68°C下聚合 2min，30个循环;和在68 °C下聚合IOmin进行。
[0120] 在分别使用EcoRV和HindIII处理后，克隆包含如此获得的PCR产物和CJl启动子 (韩国专利号0620092)的pCL1920质粒。使用克隆的质粒转化大肠杆菌DH5a，并且通过从含 有壮观霉素(50yg/mL)的LB平板选择转化的大肠杆菌DH5a来获得质粒。如此获得的质粒命 名为pCL_Pcjl_cvi metX。
[0121] 3-5.构建用于增强生物合成基因的2拷贝菌株的载体
[0122] (1)用于ppc插入的pSG76c载体的构建
[0123]在本实施例中，构建了pSG76c-2ppc，其是用于插入包含编码磷酸稀醇丙酮酸羧化 酶的ppc基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
[0124] ppc基因的核苷酸序列信息是基于NIH GenBank数据库(NCBI登记号gi :89110074) 获得的，并且基于该信息合成引物（SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20)--其包括从ppc基因 的位置-200的ppc 0RF，以及EcoRI-和SacI限制酶切位点--和引物（SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22)--其包括Sac I和Kpn I限制酶切位点。
[0125] <SEQ ID N0:19>
[0126] 5'gccggaattc tgtcggatgc gatacttgcg c 3'
[0127] 〈SEQ ID N0:20>
[0128] 5'gaaggagctc agaaaaccct cgcgcaaaag 3'
[0129] <SEQ ID N0:21>
[0130] 5'gccggagctc tgtcggatgc gatacttgcg c 3'
[0131] <SEQ ID N0:22>
[0132] 5'gaagggtacc agaaaaccct cgcgcaaaag 3'
[0133] 使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQ ID NO: 19与20和SEQ ID NO: 21 与22的引物进行PdPfuUltra?高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶，并且通过在 94°C下变性3min;在94°C下变性30 s、在56°C下退火30 s和在68°C下聚合5min，30个循环；和 在68 °C下聚合7min进行PCR。结果，获得了包含EcoRI-与SacI限制酶切位点和SacI-与KpnI 限制酶切位点的具有大约3. Ikb大小的扩增的ppc基因。
[0134] 在使用EcoRI和SacI，以及SacI和KpnI处理通过PCR获得的ppc基因的末端后，将得 到的ppc基因连接至pSG76c载体(J Bacteriol · 1997Jul; 179(13): 4426-8)，该载体已经使 用EcoRI和KpnI处理，并且最终构建了将ppc基因的两个拷贝克隆入其中的pSG76c-2ppc重 组载体。
[0135] (2)用于aspC插入的？5676(3载体的构建
[0136]在本实施例中，构建了pSG76c-2aspC，其是用于插入包含编码天冬氨酸转氨酶的 aspC基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
[0137] aspC基因的核苷酸序列信息是基于NIH GenBank数据库（NCBI登记号gi : 85674274)获得的，并且基于该信息合成引物（SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24)--其包括 从aspC基因的位置-200的aspC ORF和SacI限制酶切位点。
[0138] <SEQ ID N0:23>
[0139] 5'tccgagctca taagcgtagc gcatcaggca 3'
[0140] <SEQ ID N0:24>
[0141] 5'tccgagctcg tccacctatg ttgactacat 3'
[0142] 使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQ ID N0:23和24的寡核苷酸的引 物进行PCR。PfuUl tra?高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶，并且通过在94 °C下变 性3min;在94°C下变性30s、在56°C下退火30s和在68°C下聚合2min，30个循环；和在68°C下 聚合7min进行PCR。结果，获得了包含BamHI限制酶切位点的具有大约1.5kb大小的扩增的 aspC基因。
[0143] 在使用BamHI处理通过PCR获得的aspC基因的末端后，将得到的aspC基因连接至 pSG76c载体(J Bacteriol · 1997Jul; 179( 13): 4426-8)，该载体已经使用BamHI处理，并且最 终构建了将aspC基因的两个拷贝克隆入其中的pSG76c-2aspC重组载体。
[0144] (3)用于asd插入的pSG76c载体的构建
[0M5] 在本实施例中，构建了pSG76c_2asd，其是用于插入包含编码天冬氨酸-半醛脱氢 酶的asd基因的大肠杆菌染色体DNA的载体。
[0146] asd基因的核苷酸序列信息是基于NIH GenBank数据库(NCBI登记号gi :89110578) 获得的，并且基于该信息合成引物（SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26)--其包括从asd基因 的位置-200的asd 0RF，以及EcoRI和XbaI限制酶切位点--和引物（SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO:28)--其包括XbaI-和EcoRI限制酶切位点。
[0147] <SEQ ID N0:25>
[0148] 5'ccggaattcc caggagagca ataagca 3'
[0149] <SEQ ID N0:26>
[0150] 5'ctagtctaga tgctctattt aactcccg 3'
[0151] <SEQ ID N0:27>
[0152] 5'ctagtctaga ccaggagagc aataagca 3'
[0153] 〈SEQ ID N0:28>
[0154] 5'ccggaattct gctctattta actcccg 3'
[0155] 使用大肠杆菌W3110的染色体作为模板，连同SEQ ID NO: 25与26和SEQ ID NO: 27 与28的寡核苷酸的引物进行PCR IfuUltra?高保真DNA聚合酶(Stratagene)被用作聚合酶， 并且PCR进行30个由在96 °C下变性30s、在50 °C下退火30s和在68 °C下聚合2min组成的循环。 结果，获得了包含EcoRI-与XbaI限制酶切位点和XbaI-与EcoRI限制酶切位点的具有大约 1.5kb大小的扩增的asd基因。
[0156] 在使用EcoRI和XbaI处理通过PCR获得的asd基因的末端后，将得到的asd基因连接 至pSG76c载体，该载体已经使用EcoRI处理，并且最终构建了将asd基因的两个拷贝克隆入 其中的pSG76c-2asd重组载体。
[0157] 实施例4:基于野生型的亲株的构建
[0158] (l)ppc、aspC 和 asd 基因的增强
[0159] 购自美国菌种保藏中心(ATCC)的大肠杆菌W3110(登录号:ATCC 9637)转化有在实 施例3-5中制备的pSG76c-2ppc、pSG76c-2aspC、pSG76c-2asd载体，将其平板接种在LB-Cm (lOg/L的酵母提取物、5g/L的NaCl、10g/L的胰胨、25yg/L的氯霉素和15g/L的琼脂)平板培 养基上，并且选择对氯霉素显示抗性的菌落。选择的转化体是其中pSG76c-2ppc载体首先插 入基因组的ppc部分的菌株。
[0160] 如此获得的菌株 其中插入了 ppc基因的2个拷贝 转化有表达I _Sce I的 pST76-ASCeP载体，该I-SceI是消化在pSG76(^^体中存在的I-SceI部分的限制酶，并且将其 平板接种在LB-Ap(10g//L的酵母提取物、5g/L的NaCl、10g/L的胰胨、100yg/L的氨苄青霉素 和15g/L的琼脂)平板培养基上，并且选择在30°C下生长的菌株。
[0161] 如此生长的菌株可以处于以下状态:其中ppc基因被扩增以具有2个拷贝或可以恢 复以具有单拷贝。在使用SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:31的引物进行PCR后，在1%琼脂糖凝 胶电泳中选择具有6.5kb的增大的基因大小的具有ppc基因的2个拷贝的菌株。作为上述过 程的结果，移除pSG76c载体的同时，ppc基因变得进一步插入。
[0162] 根据上面描述的方法，使用pSG76c_2aspC和pSG76c_2asd载体连续地构建具有 ppC、asd和aspC基因的扩增拷贝的W3110菌株。在该过程期间，具有aspC基因的2个拷贝的菌 株构建是在使用SEQ ID N0:32和SEQ ID N0:33的引物进行PCR后，通过在1%琼脂糖凝胶电 泳中鉴定具有3.2kb的增大的大小的基因来确认的，而具有asd基因的2个拷贝的菌株构建 是在使用SEQ IDN0:34和SEQ ID N0:35的引物进行PCR后，通过在1%琼脂糖凝胶电泳中鉴 定具有3.2kb的增大的大小的基因来确认的。如此构建的菌株命名为CJW2。
[0163] <SEQ ID N0:30>
[0164] CTGGCTCAATTAATCAGGCTC
[0165] <SEQ ID N0:31>
[0166] CGAGGGTGTTAGAACAGAAGT
[0167] <SEQ ID N0:32>
[0168] TGGTGAACTACTTTGAAGTGG
[0169] <SEQ ID N0:33>
[0170] TGCGGCACGAGCGCCTTATCC
[0171] <SEQ ID N0:34>
[0172] GCTCGTAGGCTAAGAAATGCC
[0173] <SEQ ID N0:35>
[0174] CAGGTAAGGCTGTGAATACTC
[0175] (2)metB、thrB 和 metA 基因的缺失
[0176] 使用CJW2菌株以与实施例3-1相同的方式构建具有metB、thrB和metA基因缺失的 菌株，并且该菌株命名为CJW2HXJW2H菌株是可以在菌株内过度地积聚高丝氨酸并且生产 0-乙酰高丝氨酸或0-琥珀酰高丝氨酸--取决于正引入的质粒的metX底物特异性--的 菌株。
[0177] 实施例5:实验菌株的构建
[0178] (1)菌株的构建
[0179]分别在实施例1_(3)和4_(2)中构建的大肠杆菌菌株CJM2和CJW2H被制备为感受态 细胞，并且经由电穿孔分别引入有在实施例3-1、3-2、3-3和3-4中构建的四种不同种类的质 粒：pCL_Pcjl_metA(wt)、pCL_Pcjl_metA#ll、pCL_Pcjl_dra metX和pCL_Pcjl_cvi metX。
[0180] (2)烧瓶培养实验
[0181] 然后，进行烧瓶测试以比较甲硫氨酸前体的种类和由每个菌株一一其分别引入有 四个种类的质粒一一生产的产量。烧瓶测试进行如下:每个菌株划线接种在LB平板上，在31 °C培养箱中培养16小时，并且将单菌落接种入3mL的LB培养基中，并且以200rpm的速率在31 °C培养箱中培养16小时。
[0182] 向250mL烧瓶添加 25mL的表1中显示的产甲硫氨酸前体的培养基，并且然后分别添 加有500yL每种先前制备的培养液。然后，烧瓶以200rpm的速率在31°C培养箱中培育40小 时，并且比较在引入有每种质粒的每种菌株中获得的甲硫氨酸前体的种类和量。结果显示 在下面的表2和3中。
[0183] [表 1]

[0189] 结果，根据表2和3，确认CJM2pCL_Pc jl_metA(wt)、CJM2pCL_Pc jl_metA#lI、CJW2H pCL_Pcjl_metA(wt)和CJW2H pCL_Pcjl_metA#l I菌株--其分别地包含大肠杆菌野生型 metA基因和metA#ll基因，这两种基因具有反馈抗性一一生产0_琥珀酰高丝氨酸，然而 CJM2pCL_Pcjl_dra metX和CJW2H pCL_Pcjl_dra metX菌株--其分别地包含源自耐辐射 球菌的metX基因--生产0-乙酰高丝氨酸。
[0190] 在源自青紫色素杆菌的metX基因的情况中，该基因与metA基因相比具有与其它 metX同源基因（直向同源物)高的同源性。然而，关于底物特异性，与一般报道的metX基因不 同，该基因是生产琥珀酰高丝氨酸的高丝氨酸琥珀酰转移酶。
[0191] 另外，在当引入大肠杆菌野生型metA(wt)基因的情况中，由于以0.3g/L的浓度添 加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制的现象，〇-琥珀酰高丝氨酸产生大约lg/L，然而，在当引 入源自青紫色素杆菌的metX基因的情况中，甚至利用野生型自身而没有任何引入的基因修 饰，0-琥珀酰高丝氨酸产生，而没有添加至培养基的甲硫氨酸的反馈抑制的现象。
[0192] 引入有pCL_Pcjl_cvi metX(CJM2pCL_Pcjl_cvi metX)的CJM2菌株在2013年6月20 日以登录号KCCM11433P保藏于由布达佩斯条约认可为国际保藏机构的韩国微生物保藏中 心(KCCM)，所述韩国微生物保藏中心位于韩国首尔的361-221，Hongje-1-dong ,Seodaemun-gu，其是韩国培养物保藏协会(Korean Federation of Culture Collection)(KFCC)的子 公司。
[0193] (3)大型发酵罐培养实验
[0194] 为了大规模生产0-琥珀酰高丝氨酸一一甲硫氨酸前体，使用CJM2pCL_Pcjl_cVi metX和CJW2H pCL_Pcjl_cvi metX菌株，在5L发酵罐中进行培养。
[0195] 将含有壮观霉素抗生素的LB平板培养基接种有CJM2pCL_Pcjl_cVi metX和CJW2H pCL_Pcjl_cvi metX菌株，并且在31°C下培养过夜。然后，将单菌落接种入含有壮观霉素的 IOmL LB培养基中，在31°C下培养5小时，并且将2mL的培养物再接种入含有200mL的种子培 养基（seed medium)的1000 mL三角瓶中。随后，生成物以200rpm的速率在31°C培养箱中培养 3小时至10小时，并且将255mL的种子培养物接种入5L发酵罐的1.7L的主要培养基中以通过 补料分批方法消耗1.3L的种子培养基，并且培养50小时至100小时。
[0196] 培养基组分的细节显示在下面的表4中。经由HPLC分析如此培养的发酵液的浓度 以及结果显示在下面的表5中。
[0197] [表 4]
[0201] 如上面的表5中所示，确认CJM2pCL_Pcjl_cVi metx菌株--其中基于产苏氨酸的 菌株作为亲株引入源自青紫色素杆菌的metX基因一一以高水平积聚0-琥珀酰高丝氨酸。
[0202] 本领域普通技术人员将认识到，本发明可以以其它具体的形式体现而不背离其精 神或基本特征。描述的实施方式在所有方面都仅被视为说明性的而非限制性的。因此，本发 明的范围由所附权利要求书而不是由上面的说明书指示。在权利要求书的等价意义和范围 内的所有变化都包括在本发明的范围内。
[0203] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 国际表格 原始保藏接收证明 由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出 至：CJ第一制糖株式会社 CJ第一制糖中心 330，DONGHO-R.O，JUNC5-GU,首尔 100-400 女飩围1?
证明上述翻译与原文内容没有相互违背 2014 <|·· 10 Jj 14 I I 专:利代理人S__ Min印
【主权项】
1. 一种分离的多肽，其对甲硫氨酸的反馈抑制具有抗性并且具有高丝氨酸ο-琥珀酰转 移酶活性，其中所述多肽具有由SEQ ID ΝΟ:29表示的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述的多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有由S E Q ID NO: 36表示的核苷酸序列。3. 产0-琥珀酰高丝氨酸的埃希氏杆菌属某种微生物，其表达对甲硫氨酸的反馈抑制具 有抗性并且具有高丝氨酸0-琥珀酰转移酶活性的多肽，其中所述多肽具有由SEQ ID N0:29 表示的氨基酸序列。4. 权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中所述埃希氏杆菌属某种微生物是 大肠杆菌。5. 权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中编码胱硫醚γ合成酶的metB基因 被进一步缺失或减弱。6. 权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中编码高丝氨酸激酶的thrB基因或 编码高丝氨酸0-琥珀酰转移酶的metA基因被进一步缺失或减弱。7. 权利要求3所述的埃希氏杆菌属某种微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸 转氨酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶被进一步增强。8. 生产0-琥珀酰高丝氨酸的方法，包括： (a) 在培养基中培养权利要求3-7中任一项所述的微生物;和 (b) 从所述微生物或所述培养基中获得0-琥珀酰高丝氨酸。
【文档编号】C12N1/21GK105829529SQ201480070310
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年10月22日
【发明人】徐昌, 徐昌一, 金素影, 申容旭, 罗光镐, 严惠媛, 许仁庚
【申请人】Cj第制糖株式会社, Cj第一制糖株式会社