一种与对虾对wssv抗性相关的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与对虾抗WSSV性状相关的分子标记及其应用。与对虾抗WSSV性状显著相关的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变,利用关联分析方法鉴定出该位点与对虾WSSV的抗性性状显著相关，AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P<0.05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。本发明标记可以作为对虾抗病育种的分子标记辅助对虾的遗传选育。
【专利说明】
一种与对虾对wssv抗性相关的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记 及其应用。
【背景技术】
[0002] 由对虾白斑综合症病毒(WSSV)引起的对虾白斑综合症是危害我国对虾产业的最 为严重的病害之一，该病毒致死率高、感染范围广、传播速率快，每年因该病毒的暴发和流 行给对虾产业造成的损失巨大。为了解决该问题，科研人员从病毒本身的特征、病毒入侵机 制、机体的免疫防御体系、环境对病毒爆发的影响等多个方面进行了系统研究，以解析病毒 暴发的过程和机制，为病害防控提供有效的技术指导。同时，遗传育种工作者也试图从遗传 选育入手，培育抗wssv的新品种。
[0003] 由于对虾WSSV致死率高，因而很难通过攻毒进行性状测试后存活的虾进行留种繁 殖下一代，只能通过全同胞或和半同胞的抗性能力来进行选择，这样带来的问题是选择效 率低，成本高，且对虾对wssv抗性的遗传力很低，难以通过传统的遗传选育来培育wssv抗性 品种。通过筛选与抗wssv性状相关的分子标记，利用该分子标记指导选留抗性个体，能够辅 助并加快抗性遗传选育的进程，为抗性品种的培育提供有效的技术手段。
[0004] Toll通路是对虾体液免疫的重要信号通路，在对虾的抗菌或抗病毒免疫中起着重 要作用。TRAF6基因是Toll信号通路中一个重要因子，在WSSV感染时其表达明显上调，提示 其可能通过调节抗菌肽(AMPs)基因的表达参与抗病毒免疫反应(Wang P.H.，Wan D.H.，Gu Z.H.,et al.Litopenaeus vannamei tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)responds to Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus (WSSV)infection and activates antimicrobial peptide genes.Dev Comp Immunol, 2011，35(1):105-114)〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在对虾免疫相关基因TRAF6中与对虾对WSSV抗性相关的分子标记 及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] -种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，与对虾的抗WSSV性状显著相关的分子标 记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变。
[0008] 所述分子标记AA基因型在抗性组中的基因频率高于易感组(P〈0.05)，提示AA基因 型为抗性优势基因型。
[0009] -种用于检测与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的引物对，引物对为：
[0010] LvTF6F:TGTCTTCGAACAAATATCACATG和LvTF6R:GGGTTGAAGTATTTTTGCAAGGG。
[0011] -种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的应用:所述对虾对WSSV抗性相关的分子 标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。
[0012 ] -种辅助抗WSSV品种的选育方法：
[0013] 1)提取待分析材料的基因组的DNA;
[0014] 2)以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行扩 增，根据扩增产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息；
[0015] 3)将上述获得的分型信息中选择A/A基因型个体进行留种和建立家系育种。
[0016] 本发明所具有的优点:本方法筛选获得的抗WSSV相关的分子标记能够从分子水平 上对抗性个体进行选择，可以解决传统选育对于一些难以从表型进行度量的性状进行选择 的困难。本发明建立的抗性分子标记辅助抗性遗传选育的方法，操作简单，时间短，为筛选 抗性品种提供了一条有效的途径。
【具体实施方式】
[0017]实施例i :对奸TRAF6基因中与抗性相关SNP分子标记的获得1.易感和抗性材料的 筛选
[0018] 选取500尾健康凡纳滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对虾检测 无WSSV感染，实验水温为(23 ± 1) °C。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含 量为104-106C〇py/ng DNA)。攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾，随机取样提取基 因组DNA，最早死亡的48尾对虾作为WSSV易感组。至攻毒后第14天，凡纳滨对虾存活情况稳 定，取存活的48尾对虾作为WSSV抗性组。
[0019] 2.基因组DNA提取
[0020] 凡纳滨对虾DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明进行。分别提 取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提取获得的DNA使用NanoDrop 1000检测DNA浓度和纯 度，将经检测DNA浓度>50ng/yl和纯度0D26Q/28()为1.7-1.9的个体DNA再经1 %的琼脂糖凝胶 电泳检测，电泳检测DNA片段完整性的个体，即为合格的DNA样品，在-20°C保存待用。
[0021] 3.TRAF6基因SNP发掘和基因组DNA序列的获得
[0022] TRAF6基因SNP的发掘参考Yu et al(Yu Y.，Wei J.，Zhang X.，Liu J,，Liu C.，Li F.,Xiang J..SNP Discovery in the Transcriptome of White Pacific Shrimp Litopenaeus vannamei by Next Generation Sequencing,PL0S ONE,2014,9(1):e87218) 文章中所述，通过转录组测序数据挖掘出TRAF6基因中的SNP位点，SNP位点周边的DNA序列 利用凡纳滨对虾基因组组装数据获得。
[0023] 4.TRAF6 基因 SNP 分型
[0024] 使用SNaPsho t多重SNP分型技术平台对TRAF6基因的SNP在抗性组和易感组材料中 进行SNP分型，获得每个个体在每个SNP位点的的基因型。
[0025] 5.抗性相关SNP位点的获得
[0026] 通过SPSS 16.0中的非参数检验方法(卡方检验，x2)对易感组和抗性组中各个SNP 位点的基因频率、基因型频率及单倍型分布进行差异检验，设置限制性的阈值P = 〇.05,结 果显示TRAF6基因组序列中SEQIDTRAF6-g的139bp处的SNP位点与抗WSSV性状呈显著相关， 该标记AA基因型在抗性组中的基因频率尚于易感组(P〈0.05)，提不AA基因型为抗性优势基 因型，有可能作为抗病对虾筛选的标记。
[0027] 其中，SEQIDTRAF6-g基因序列如下：
[0030] (a)序列特征
[0031] *长度:279碱基对
[0032] *类型：核酸
[0033] *链型：双链
[0034] *拓扑结构:线性
[0035] (b)分子类型：DNA
[0036] (c)假设:否
[0037] ⑷反义:否
[0038] (e)最初来源:凡纳滨对虾
[0039]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此 在不偏离本发明精神的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，其特征在于：与对虾抗WSSV性状显著相关 的分子标记为位于TRAF6基因的DNA序列SEQIDTRAF6g的139bp位置，为A>G型突变。2. 按权利要求1所述的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记，其特征在于:利用关联分析 方法鉴定出该位点与对虾WSSV的抗性性状显著相关，AA基因型在抗性组中的基因频率显著 高于易感组(P〈〇. 05)，提示AA基因型为抗性优势基因型。3. -种用于检测权利要求1所述的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的引物对，其特 征在于：引 物对为：LvTF6F:TGTCTTCGAACAAATATCACATG 和LvTF6R: GGGTTGAAGTATTTTTGCAAGGG 〇4. 一种权利要求1的与对虾对WSSV抗性相关的分子标记的应用，其特征在于:所述对虾 对WSSV抗性相关的分子标记在遗传多样性分析筛选、分子标记辅助育种中的应用。5. -种辅助抗WSSV品种的选育方法，其特征在于： 1) 提取待分析材料的基因组的DNA; 2) 以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行扩增， 根据扩增产物获得SNP位点进行分型，获得分型信息； 3) 将上述获得的分型信息中选择A/A基因型个体进行留种和建立家系育种。
【文档编号】C12N15/11GK105821155SQ201610393071
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李富花, 于洋, 刘敬文, 相建海, 张晓军
【申请人】中国科学院海洋研究所