一种制备人凝血酶原复合物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)精制纯化；(4)配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。本发明方法FIX回收率高达约58?67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景良好。
【专利说明】
一种制备人凝血酶原复合物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于血液制品领域，具体涉及一种制备人凝血酶原复合物的方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血酶原复合物，主要用于治疗先天性和获得性凝血因子n、W、K、X缺乏症 (单独或联合缺乏)包括：1.凝血因子IX缺乏症（乙型血友病），以及n、w、x凝血因子缺乏 症;2.抗凝剂过量、维生素K缺乏症;3.肝病导致的出血患者需要纠正凝血功能障碍时;4.各 种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者，但对凝血因子V缺乏者可能无效;5. 治疗已产生因子珊抑制物的甲型血友病患者的出血症状;6.逆转香豆素类抗凝剂诱导的出 血。
[0003] 人凝血酶原复合物是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的反应条件和保护剂 的使用对工艺中FIX收率有显著性影响，但是目前制备人凝血酶原复合物的方法存在FIX回 收率低，对血浆中其他有效成分影响大的问题。
[0004] 如，魏舒等，"冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究"，中国输血杂志，2008，21
[4] :282~284公开了一种人凝血酶原复合物生产工艺，制品经过S/D病毒灭活时未采取合 适的保护剂，凝血因子II、VII、IX和X活性回收率分别损失20 %左右。
[0005] 公告号10 2151289B的专利申请公开了 一种制备人凝血酶原复合物的方法，其FIX 回收率仅为45~49万IU/吨血浆，且未采取降低人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附 的步骤，导致宝贵的血浆资源浪费。
[0006] 公开号为104109202A的专利申请也公开了一种制备人凝血酶原复合物的方法，其 FIX回收率较高，但是其工艺中多步澄清过滤增加操作难度和生产成本，并且按照柱床体积 与上样的血浆量的比例为1:10~1:50来计算，要实现1吨血浆/批的处理，使用凝胶量为20 ~100L，按Capto DEAE市场价格计算，凝胶成本为300~1500万元，远远高于每吨血衆实现 人凝血酶原复合物价值，因此，成本太高，实际应用价值不大。
[0007] 因此，需要提供一种成本低廉的、FIX回收率高的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种人凝血酶原复合物的制备方法。
[0009] 去冷沉淀上清血浆:即去冷沉淀血浆。
[0010] 本发明人凝血酶原复合物的制备方法，它包括如下步骤：
[0011] (1)预纯化
[0012] 取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10~15°C和7.0~7.4，按照每1L上清 血浆使用1.4~1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平 衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；
[0013] (2)S/D 病毒灭活；
[0014] (3)精制纯化
[0015] 将制品温度和pH分别调节至10~15°C和7.0~7.4，按照每1L上清血浆使用1.2~ 1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤 缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析；
[0016] (4)干热处理，即可。
[0017] 步骤（1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸 橼酸钠的溶液。
[0018] 优选地，
[0019] 平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0 ? 08mol/L、0 ? Olmol/L;
[0020] 洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.17~0.23mol/L、0.0 lmol/L;
[0021] 洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2.0mol/L、0.015mol/L。
[0022] 步骤（1)中，吸附的时间为45~60min。
[0023] 步骤（1)中，透析采用的透析液是温度为15~25°C、pH为7.0~7.4的浓度为 0.015mol/L的枸橼酸钠溶液。
[0024] 步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法是:取步骤（1)制得的制品，加入肝素钠，再加 入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终浓度分别为1 % (w/v)和0.3% (v/v)，待制品温 度达到24°C开始计时，控制温度24~26°C，时间6小时。其中，肝素钠的加入量为1~3IU/ml 制品。
[0025] 步骤(3)中，吸附的时间为30~60min。
[0026] 步骤(3)中，透析采用的透析液是含0. lmo 1/L NaCl、0.015mo 1/L枸橼酸钠、20g/L 甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸的溶液，其温度为15~25°C、pH为6.9~7.1。
[0027]步骤(4)中，配置时加入肝素钠，肝素钠加入量是制品中FIX含量的0.1~0.3倍。 [0028] 步骤(4)中，干热处理的条件是80°C干热处理72小时。
[0029] 本发明方法FIX回收率高达约58-67万IU/吨血浆，且对人血白蛋白和免疫球蛋白 的非特异性吸附少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且无需采用柱层析等高成本的方法，成 本低廉，应用前景良好。
[0030]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0032] 图1为人凝血酶原复合物的制备流程图。
【具体实施方式】
[0033] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照试剂盒 说明书选择。
[0034]实验试剂：枸橼酸钠，氯化钠，甘氨酸，盐酸赖氨酸，DEAE Sephadex A50凝胶均为 市售品。
[0035]实施例1本发明人凝血酶原复合物的制备方法 [0036] 一、制备方法
[0037] ⑴预纯化
[0038]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至10°C，用醋酸缓冲液将pH 调整到7.0。按1.4g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀后的凝胶，吸附时间为45min。 收集凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进 行超滤透析，完成后计量制品的体积。
[0039] (2)S/D病毒灭活
[0040]按1 IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液，使最终 Tween~80和TNBP的浓度分别为1 %和0.3%。待制品温度达到24°C开始计时，控制温度24~ 26°C，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次。
[0041 ] (3)精制纯化
[0042] 将制品温度和pH分别调整到10°C和7.0,按1.2g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例 添加溶胀后的凝胶，吸附时间为30min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液 处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并 抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加 入肝素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。
[0043] (4)干热处理
[0044] 冻干后的制品经80°C、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完 成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。
[0045] 其中，平衡液含0 ? 08mol/L NaCl和0 ? 01mol/L枸橼酸钠，温度值为10 °C，pH值为 7.0；
[0046] 洗涤液含0 ? 17mol/L NaCl和0 ? 01mol/L枸橼酸钠，温度值为10°C，pH值为7 ? 0;
[0047] 洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为10°C，pH值为7.0;
[0048] 首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15°C，pH值为7.0;
[0049] 二次透析液含0 . lmol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖 氨酸，温度值为15°C，pH值为6.9;
[0050] S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。
[0051] 二、检测
[0052] 1、检测方法
[0053] (1 )FIX收率的检测方法:按《中国药典》2015年版三部"人凝血因子IX效价测定法 (通则3519)"检定。
[0054] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法:按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分 析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。
[0055] 2、检测结果
[0056] (l)FIX 回收率
[0057] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为58万(FIX IU/吨血浆）。
[0058] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率
[0059] 结果如下表：
[0061 ]可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收 率高达100%和98%。
[0062]实施例2本发明人凝血酶原复合物的制备方法 [0063] 一、制备方法
[0064] ⑴预纯化
[0065]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至13°C，用醋酸缓冲液将pH 调整到7.2。按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为50min。收集 凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超 滤透析，完成后计量制品的体积。
[0066] ⑵S/D病毒灭活
[0067] 按2IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween~80和TNBP的浓 度分别为1 %和〇. 3 %。待制品温度达到24°C开始计时，控制温度24~26°C，时间6小时，每半 个小时记录制品温度一次。
[0068]⑶精制纯化
[0069] 将制品温度和pH分别调整到13°C和7.2,按1.3g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例 添加溶胀凝胶，吸附时间为45min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理 凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样 检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.2IU/IU FIX加入肝 素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。
[0070] ⑷干热处理
[0071] 冻干后的制品经80°C、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。
[0072]干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。
[0073] 其中，平衡液含0 ? 08mol/L NaCl和0 ? 01mol/L枸橼酸钠，温度值为13 °C，pH值为 7.2；
[0074] 洗涤液含0.20111〇1/1恥(：1和0.01111〇1/1枸橼酸钠，温度值为13°(：411值为7.2 ;
[0075] 洗脱液含2.0111〇1/1恥(：1和0.015111〇1/1枸橼酸钠，温度值为13。(：411值为7.2 ;
[0076]首次透析液含0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为20°C，pH值为7.2;
[0077] 二次透析液含0 ? lmol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖 氨酸，温度值为20 °C，pH值为7.0;
[0078] S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。
[0079] 二、检测
[0080] 1、检测方法
[0081 ] (1 )FIX收率的检测方法:按《中国药典》2015年版三部"人凝血因子IX效价测定法 (通则3519)"检定。
[0082] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法:按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分 析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。
[0083] 2、检测结果
[0084] (l)FIX 回收率
[0085] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为67万(FIX IU/吨血浆）。
[0086] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率
[0087] 结果如下表：
[0089] 可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收 率高达101%和102%。
[0090] 实施例3本发明人凝血酶原复合物的制备方法
[0091] 一、制备方法
[0092] ⑴预纯化
[0093]将原料血浆融化，离心去除冷沉淀，将冷上清血浆升温至15°C，用醋酸缓冲液将pH 调整到7.4。按1.6g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集 凝胶，依次采用平衡、洗涤和洗脱缓冲液处理凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超 滤透析，完成后计量制品的体积。
[0094] ⑵S/D病毒灭活
[0095] 按3IU/ml制品比例加入肝素钠后，再加入S/D储备液使最终Tween~80和TNBP的浓 度分别为1 %和〇. 3 %。待制品温度达到24°C开始计时，控制温度24~26°C，时间6小时，每半 个小时记录制品温度一次。
[0096]⑶精制纯化
[0097] 将制品温度和pH分别调整到15°C和7.4,按1.5g A50凝胶干粉/L冷上清血浆比例 添加溶胀凝胶，吸附时间为60min。收集凝胶，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱缓冲液液处理 凝胶。收集的洗脱液经澄清过滤后，再进行超滤透析，透析结束后，对制品进行计量，并抽样 检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.3IU/IU FIX加入肝 素钠，混匀。除菌分装后的制品应立即冻干。
[0098] ⑷干热处理
[0099]冻干后的制品经80°C、72小时干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。
[0100]干热处理完成后即得人凝血酶原复合物成品，检定结果如表1所示。
[0101] 其中，平衡液含0.08mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为15°C，pH值为 7.4；
[0102] 洗涤液含0.23111〇1/1恥(：1和0.01111〇1/1枸橼酸钠，温度值为15°(：411值为7.4 ;
[0103] 洗脱液含2. Omol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为15°C，pH值为7.4;
[0104]首次透析液含0.015111〇1/1枸橼酸钠，温度值为25°(：411值为7.4;
[0105] 二次透析液含0.1mol/L NaCl，0.015mol/L枸橼酸钠，20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖 氨酸，温度值为25°C，pH值为7.1;
[0106] S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯加注射用水至1L的方法制备。
[0107] 二、检测
[0108] 1、检测方法
[0109] (1 )FIX收率的检测方法:按《中国药典》2015年版三部"人凝血因子IX效价测定法 (通则3519)"检定。
[011 0] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的检测方法:按贝克曼库尔特IMMAGE800特定蛋白分 析系统及其配套试剂检测白蛋白和免疫球蛋白含量。
[0111] 2、检测结果
[0112] (l)FIX 回收率
[0113] 经检测，本发明工艺的FIX回收率为63万(FIX IU/吨血浆）。
[0114] (2)人血白蛋白和免疫球蛋白的收率
[0115] 结果如下表：
[0117] 可以看出，采用本发明方法制备人凝血酶原复合物，白蛋白和免疫球蛋白的回收 率高达103%和103%。
[0118] 将本发明方法制备得到的产品进行质量检测，检测结果如下：
[0119] 表1成品检定结果
[0121] 实验结果说明，本发明方法制备的人凝血酶原复合物凝血因子含量均衡，安全、有 效。
[0122] 本发明所建立的人凝血酶原复合物制备方法，反应条件温和，对S/D处理、冻干及 干热处理过程中合理使用保护剂，有效的实现了凝血因子的分离纯化，降低了凝血因子激 活的风险;并且工艺稳定性高，批件差异小，凝血因子含量均衡，能很好的发挥临床使用效 果;再者采用S/D病毒灭活和80°C、72小时干热处理的两步病毒灭活方法，制品病毒安全性 得到极大提尚。本发明能稳定且可靠的制备出安全、有效的制品。
[0123] 为了进一步说明本发明的有益效果，下面从技术提高带来的商业价值来阐述：
[0124] 现有技术中，采用吸附法制备人凝血酶原复合物的方法，FIX回收率仅为45~49万 IU/吨血浆，而本发明吸附法的回收率高达58~67万IU/吨血浆，也就是说，采用本发明方法 制备人凝血酶原复合物，每吨血浆比现有方法可以多收9~22万IU/吨血浆。
[0125] 按照每年投浆600吨来计算，采用本发明方法，可多回收5400~12000万IU FIX，以 市场价格约0.8元/IU计算，可增加4320~15000万元收入。
[0126] 综上，本发明方法FIX回收率高，且对人血白蛋白和免疫球蛋白的非特异性吸附 少，不会导致宝贵的血浆资源浪费，且未采用柱层析等高成本的方法，成本低廉，应用前景 良好。
【主权项】
1. 一种人凝血酶原复合物的制备方法，其特征在于:它包括如下步骤： (1) 预纯化 取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10~15°C和7.0~7.4，按照每1L上清血浆 使用1.4~1.6g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡缓 冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； (2) S/D病毒灭活； (3) 精制纯化 将制品温度和pH分别调节至10~15 °C和7.0~7.4，按照每1L上清血浆使用1.2~1.5g A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附;收集凝胶，依次采用平衡缓冲液、洗涤缓冲液 和洗脱缓冲液处理凝胶，收集洗脱液，超滤透析； (4) 配制，除菌，分装，冻干，干热处理，即可。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)和步骤(3)中，平衡缓冲液、洗 涤缓冲液和洗脱缓冲液均是含有NaCl和枸橼酸钠的溶液。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于： 平衡缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0.08mo 1/L、0.0 lmo 1/L; 洗涤缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为0 · 17~0 · 23mol/L、0 .Olmol/L; 洗脱缓冲液中，NaCl、枸橼酸钠的浓度分别为2. Omo 1/L、0.015mo 1/L。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，吸附的时间为45~60min。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，透析采用的透析液是温度 为15~25°C、pH为7.0~7.4的浓度为0.015mol/L的枸橼酸钠溶液。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述S/D病毒灭活的方法 是：取步骤（1)制得的制品，加入肝素钠，再加入Tween-80和TNBP使Tween-80和TNBP的最终 浓度分别为1 % (w/v)和0.3 % (v/v)，待制品温度达到24 °C开始计时，控制温度24~26 °C，时 间6小时。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于:肝素钠的加入量为1~3IU/ml制品。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，吸附的时间为30~60min。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)中，透析采用的透析液是含 0. lmol/L NaCl、0.015m〇VL枸橼酸钠、20g/L甘氨酸和5g/L盐酸赖氨酸的溶液，其温度为15 ~25°C、pH为6.9~7.1。10. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，配置时加入肝素钠，肝素 钠加入量是制品中FIX含量的0.1~0.3倍。11. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，干热处理的条件是80°C 干热处理72小时。
【文档编号】C12N9/64GK105821024SQ201610379619
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】余伟, 鲁涛, 牟蕾, 李伟, 王黔川
【申请人】成都蓉生药业有限责任公司