一种木聚糖酶热敏突变体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明是一种木聚糖酶热敏突变体，该突变体序列如SEQ ID No.1所示，制备方法包括：1)将突变序列s02b12和表达载体相连接，并将连接产物转化大肠杆菌，获得包含s02b12的重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组突变木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的突变木聚糖酶S02B12；4)木聚糖酶S02B12的活力测定。本发明突变酶S02B12最适pH为5.5、温度为50℃，经胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下处理1h，酶活几乎无损失，与野生酶相比，突变木聚糖酶S02B12的热性质发生了改变，其在60℃时活性更低，在37℃失活更迅速，其在37℃下的半衰期小于5min，可应用于低温生物技术等领域，特别是食品行业。
【专利说明】
一种木聚糖酶热敏突变体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种木聚糖酶热敏突变 体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物细胞壁是地球上含量丰富的生物质，主要由木质素、纤维素和半纤维素组成。 木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，其降解依赖木聚糖酶。木聚糖酶将木聚糖降解为 木寡糖和/或木糖，因此木聚糖酶可调节植物细胞生长，并可应用于饲料、食品、酿酒、纺织 及造纸等领域。
[0003] 热敏感的酶热稳定性差，容易热失活。该特性使酶的催化反应得以简易控制，在低 温生物技术等领域具有应用的价值，特别是当催化底物中存在热敏感的物质时，该特性使 酶更具应用优势。例如，木聚糖酶可辅助果汁澄清，但果汁里的维生素C和B族属于热敏感物 质，不宜加热;利用热敏感的木聚糖酶，可在低温处理果汁，然后在较低的温度下使酶失活， 既避免果汁中的营养流失及风味改变，又易于控制果汁的澄清度。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种木聚糖酶热敏突变体及其制 备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种木聚糖酶突变体S02B12，所述突 变体S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0006] 本发明的第二目的是提供一种木聚糖酶突变体S02B12编码基因，其核苷酸序列如 SEQIDNo.2**。
[0007] 本发明的第三目的是提供一种包含有突变木聚糖酶基因s02bl2的重组载体。
[0008] 本发明的第四目的是提供一种包含有突变木聚糖酶基因 S〇2bl2的重组菌。
[0009] 本发明的第五目的是提供一种木聚糖酶突变体S02B12在食品加工的中应用。
[0010] 本发明根据GenBank记录的节杆菌（Arthrobacter sp .)木聚糖酶核苷酸序列 JQ863105(SEQ ID No.3)和列舍瓦里尔菌（Lechevalieria sp.)JF745868(SEQ ID No.4)， 利用易错PCR和DNA Family shuffling PCR的方法，以70°C为条件，筛选获得突变体 S02B12。突变体S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示，其是JQ863105和JF745868编码氨 基酸序列的杂合序列。
[0011]本发明制备突变木聚糖酶S02B12的方法按以下步骤进行：
[0012] 1)将s02bl2和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold (DE3)，获得包含S〇2bl2的重组菌株；
[0013] 2)培养重组菌株，诱导重组突变木聚糖酶表达；
[0014] 3)回收并纯化所表达的突变木聚糖酶S02B12;
[0015] 4)木聚糖酶S02B12的活性测定。
[0016]与野生酶相比，突变木聚糖酶S02B12的热性质发生了改变，其对热更敏感，纯化的 突变酶S02B12、野生纯化酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为50 °C、50 °C和75 °C，在 l〇°C分别具有25.4%、38.3%和13.5%的酶活，在60°(：分别具有61.8%、85.9%和92.7%的 酶活;rXynAHJ3在37°C下稳定，rXynAGN16L在37°C时半衰期约为60min，而S02B12在37°C迅 速失活，其半衰期小于5min。
[0017]本发明的有益技术效果是:本发明突变酶S02B12最适pH为5.5，最适温度为50°C， 经胰蛋白酶和蛋白酶K在37°C下处理lh，S02B12的酶活几乎无损失，与野生酶相比，突变木 聚糖酶S02B12的热性质发生了改变，其在60°C时活性更低，在37 °C失活更迅速，其在37 °C下 的半衰期小于5min，可应用于低温生物技术等领域，特别是食品行业。
【附图说明】
[0018]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0019] 图1:在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S02B12 的SDS-PAGE分析，其中，CK:蛋白质Marker;
[0020] 图2:重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S02B12的pH活性；
[0021] 图3:重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S02B12的pH稳定性；
[0022] 图4:重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S02B12的热活性；
[0023] 图5:重组木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S02B12的热稳定性；
【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025] 试验材料和试剂
[0026] 1、菌株及载体:大肠杆菌Escherichia coli BL21_Gold(DE3)和表达载体pEasy- E2购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌（Art hr obac ter sp.)和列舍瓦里尔菌 (Lechevalieria sp.)由云南师范大学提供。
[0027] 2、酶类及其它生化试剂:DNA聚合酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，山 毛榉木聚糖购自Sigma公司，易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，细菌基因 组提取试剂盒购自GENE STAR公司，PopCulture?细胞裂解液购自德国默克集团有限公司， 其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0028] 3、培养基：
[0029] LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 1000ml，pH自 然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0030] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0031] 实施例1:突变文库的构建
[0032] 按照GENE STAR公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(Arthrobacter sp ?)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组。根据GenBank木聚糖酶序列JQ863105和 JF745868,设计引物5'GTCTCGGCCCCGCCGGACGT 3'和5'GGCTCGCTTCGCCAGCGTGG 3'，以列舍 瓦里尔菌(Lechevalieria sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得木聚糖酶基因xynAHJ3,另 设计引物5'GTGCAGCCGGAGGAAAAACG 3'和5'GATGAAGGCAGGATCCGGGGT 3'，以节杆菌 (Arthrobacter sp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得木聚糖酶基因xynAGN16L。
[0033] PCR反应参数为：94°C变性5min;然后94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 lmin 30sec，30个循环后72°C保温lOmin。
[0034]以上述PCR产物为模板，利用易错PCR试剂盒，按照试剂盒说明书进行基因突变。用 超声打断仪8;1〇1'1^丨61'对易错?0?产物进行超声随机打断，打断产物经2%琼脂糖凝胶电泳 后切胶纯化。
[0035] 纯化后的小片段DNA自身互为引物和模板进行DNA Family shuffling PCR，PCR反 应参数为：96°C变性lmin 30sec;然后94°C变性30sec，依次65°C退火90sec、62°C退火 90sec、59°C 退火 90sec、56°C 退火 90sec、53°C 退火 90sec、5(TC 退火 90sec、47°C 退火 90sec、 44°C退火90sec、41°C退火90sec，72°C延伸lmin 30sec，35个循环后72°C保温7min。
[0036] 以纯化的DNA Family shuffling PCR产物为模板，用木聚糖酶基因xynAHJ3和 xynAGN16L扩增引物和反应条件进行序列全长扩增，含突变序列和未突变序列。将序列全长 扩增产物和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-G 〇ld(DE3)，经过 夜培养，从转化平板中挑取单菌落于含有150yL液体LB培养液(含100yg mdmp)的96孔细 胞培养板中，于37°C，快速振荡培养约16h后，每孔加入40% (w/w)的甘油50此，混匀后于-70 °C保存。
[0037]实施例2:突变体的筛选
[0038]从保存突变文库的96孔细胞培养板中取2yL菌液，接种于含200yL/孔液体LB培养 液(含l〇〇yg mL-Imp)的96深孔板中，于37°C，200rpm振荡培养至0D_>1.0(约20h)，加入含 2mM IPTG和100yg mL-Imp的200yL液体LB培养液，于20°C，160rpm过夜诱导。诱导结束后加 入40yL/孔的PopCulture?细胞裂解液，在25 °C下，震荡裂解细胞30min。取50yL含1.0 % (w/ v)山毛榉木聚糖的Mcllvaine缓冲液(pH=7.0)及50yL细胞裂解产物，在96深孔板中于70°C 恒温箱中反应2h。反应结束后加入150yL DNS试剂终止反应，于140°C恒温箱中保温20min以 上并冷却至室温，使用酶标仪读取ODw?的值，以只含有PEASY-E2空载体的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株裂解液反应组作为对照。比较突变体与野生重组酶rXynAGN16L和rXynAHJ3 的酶活大小，获得热稳定性降低的1个突变体，编号为S02B12,该突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该突变体核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0039] 实施例3:突变体S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶制备
[0040] 将突变体S02B12、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3以0.1%的接种量分别接种于1^ (含100yg mPAmp)培养液中，37°C快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1 %接种量接种到 新鲜的LB (含100yg mPAmp)培养液中，快速振荡培养约2-3h (0D6QQ达到0.6-1.0)后，加入终 浓度0.1 mM的IPTG进行诱导，于20°C继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用 适量的pH=7.0Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩 的粗酶液经13000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分 别亲和和纯化目的蛋白。SD S -PAGE结果（图1)表明，突变酶SO 2 B12、野生酶r Xy n AGN16 L和 rXynAHJ3都获得了纯化，产物为单一条带。
[0041 ] 实施例4:突变体S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的性质测定 [0042] (1)、突变体S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的活性分析
[0043]活性测定方法采用3，5 -二硝基水杨酸(DNS)法:将底物溶于缓冲液中，使其终浓 度为0.5% (w/v);反应体系含100此适量酶液，900yL底物;底物在反应温度下预热5min后， 加入酶液后再反应l〇min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm 波长下测定0D值；1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生lymol还原 糖（以木糖计)所需的酶量。
[0044] (2)、突变体S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的pH活性和pH稳定 性测定：
[0045] 酶的最适pH测定:将酶液置于37°C下和pH = 4.0-12.0的缓冲液中进行酶促反应。 酶的pH稳定性测定：将酶液置于pH= 3.0-12.0的缓冲液中，在37°C下处理lh，然后在pH = 7.0及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为:Mcllvaine buffer(pH= 3.0-8.0)和0.1]?817(^116-恥011(口11=9.0-12.0)。以山毛榉木聚糖为底物，反应10111111，测定 纯化的木聚糖酶的酶学性质。结果表明：S02B12和rXynAGN16L的最适pH均为5.5，rXynAHJ3 的最适pH为6.0(图2);在pH=7.0和pH=8.0时，S02B12的稳定性与野生酶rXynAGN16L相似， 而在pH=6 ? 0和pH=9 ? 0-11 ? 0，S02B12的稳定性差，其酶活低于rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶 活20%以上（图3)。
[0046] (3)、突变体S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的纯化酶的热活性及热稳定 性测定：
[0047]酶的热活性测定:在pH = 7.0的缓冲液中，于0-90°C下进行酶促反应。酶的热稳定 性测定:将同样酶量的酶液置于37°C处理0-60min后，在pH = 7.0及37°C下进行酶促反应，以 未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应lOmin，测定纯化的木聚糖酶的酶学 性质。结果表明：S02B12、rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适温度分别为50°C、50°C和75°C，在10 °(：分别具有25.4%、38.3%和13.5%的酶活，在60°(：分别具有61.8%、85.9%和92.7%的酶 活（图4);rXynAHJ3 在 37°C 下稳定，rXynAGN16L 在 37°C 时半衰期约为 60min，而 S02B12 在 37°C 迅速失活，其半衰期小于5min(图5)。
[0048] (4)、蛋白酶抗性测定：
[0049] 酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍(w/w)的胰蛋白酶(pH=7.5)和蛋白酶K(pH =7.5)在37 °C对重组酶处理lh，然后在pH=7.0及37 °C下进行酶促反应，以置于蛋白酶对应 pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。结果表明：经胰蛋白酶和蛋白酶K在37 °C下处理 lh，S02B12、rXynAGN16L 和 rXynAHJ3 的酶活几乎无损失。
[0050] 本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术 语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该 理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意 义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0051]最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参 照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本 发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均 应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种木聚糖酶突变体S02B12,其特征在于，所述突变体S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。2. 根据权利要求1所述木聚糖酶突变体S02B12，其特征在于，所述突变体S02B12编码基 因 s02bl2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3. 根据权利要求2所述包含有突变木聚糖酶基因 S〇2bl2的重组载体。4. 根据权利要求2所述包含有突变木聚糖酶基因 S〇2bl2的重组菌。5. 根据权利要求1~4任一项所述木聚糖酶突变体S02B12在食品加工中的应用。6. 根据权利要求1~4任一项所述木聚糖酶突变体S02B12的制备方法，其特征在于，步 骤包括： 1) 将S〇2bl2和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold (DE3)，获得包含S〇2bl2的重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组突变木聚糖酶表达； 3) 回收并纯化所表达的突变木聚糖酶S02B12; 4) 木聚糖酶S02B12的活性测定。
【文档编号】C12N15/56GK105821022SQ201610334847
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】周峻沛, 张蕊, 黄遵锡, 沈骥冬, 唐湘华, 李俊俊, 吴倩, 慕跃林
【申请人】云南师范大学