一种表达鸡ibdv抗体的重组ndv及其在制备双价疫苗中的应用

一种表达鸡ibdv抗体的重组ndv及其在制备双价疫苗中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种表达鸡IBDV抗体的重组NDV及其在制备双价疫苗中的应用。本发明提供的重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA包括如下元件：抗体基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因。所述抗体为鸡IBDV抗体。本发明中，创造性的用病毒乙的抗体蛋白取代了病毒乙的抗原蛋白，可以为接种动物同时提供主动免疫和被动免疫，为疫苗构建提供了一种新思路。本发明提供的“抗体疫苗”填补了疫苗不能提供被动免疫的空白，为疫苗研究开辟了崭新的研究领域，对我国乃至全世界传染病的预防和治疗起到重要作用。
【专利说明】
一种表达鸡IBDV抗体的重组NDV及其在制备双价疫苗中的 应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种表达鸡IBDV抗体的重组NDV及其在制备双价疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002]新城疫病(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的疾病，NDV为RNA病毒。传染性法氏囊病 (IBD)是由传染性法氏囊病毒（IBDV)引起的疾病，IBDV为RNA病毒。新城疫病和传染性法氏 囊病是危害养禽业的重要传染病。
[0003] 按照传统方法进行单苗免疫，既费时又费力。随着反向遗传操作技术的成熟，表达 外源保护性抗原基因的重组NDV二联活载体疫苗取得了一定的进展。在免疫实践中外源保 护性抗原的免疫效果不理想，其原因主要是外源基因在脱离病原体后半衰期变短，少则几 分钟，多不过数小时，所以抗原浓度很难达到引起足够的抗体反应的程度。
[0004] IBD疫苗接种后对接种鸡的法氏囊产生一定的破坏作用，从而影响其它疫苗的免 疫效果。因此使用法氏囊卵黄抗体进行被动免疫已经成为预防和治疗IBDV感染常规的手 段。然而，法氏囊卵黄抗体除了成本高外，还存在严重的垂直和水平传播疾病的风险，此外， 用动物材料生产生物制品给质量控制带来无法克服的困难。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种表达鸡IBDV抗体的重组NDV及其在制备双价疫苗中的应 用。
[0006] 本发明首先保护一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒 PBrClone30-antiIBDVfullAb、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并 培养，得到所述重组新城疫病毒;所述重组质粒pBrClone3〇-antiIBDVfullAb中包括如下元 件:抗体基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒 的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述抗体为病毒抗体。
[0007] 所述抗体基因位于所述新城疫病毒的P基因和所述新城疫病毒的M基因之间。
[0008] 所述重组质粒pBrClone30_antiIBDVfullAb中可依次包括如下元件:新城疫病毒 的NP基因、新城疫病毒的P基因、抗体基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城 疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因。
[0009] 所述抗体具体可为鸡IBDV抗体。
[0010] 鸡IBDV抗体的重链可变区可为如下(al)或(a2)或(a3):(al)序列表的序列2自N末 端第22至143位氨基酸残基组成的多肽；（a2)将(al)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；（a3)与（al)具有90%以上同源性且具有相同功 能的多肽。
[0011] 鸡IBDV抗体的重链恒定区可为如下(a4)或(a5)或(a6):(a4)序列表的序列2自N末 端第144至571位氨基酸残基组成的多肽；（a5)将(a4)经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；（a6)与(a4)具有90%以上同源性且具有相同 功能的多肽。
[0012] 鸡IBDV抗体的重链可为如下(a7)或(a8)或(a9)或(al0):(a7)序列表的序列2自N 末端第22至571位氨基酸残基组成的多肽；（a8)序列表的序列2所示的多肽；（a9)将(a7)或 (a8)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽； (alO)与(a7)或(a8)具有90%以上同源性且具有相同功能的多肽。
[0013] 鸡IBDV抗体的轻链可变区可为如下(bl)或(b2)或(b3):(bl)序列表的序列3自N末 端第22至126位氨基酸残基组成的多肽；（b2)将(bl)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；（b3)与（bl)具有90%以上同源性且具有相同功 能的多肽。
[0014] 鸡IBDV抗体的轻链恒定区可为如下(b4)或(b5)或(b6):(b4)序列表的序列3自N末 端第127至229位氨基酸残基组成的多肽；（b5)将(b4)经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽；（b6)与(b4)具有90%以上同源性且具有相同 功能的多肽。
[0015] 鸡IBDV抗体的轻链可为如下(b7)或(b8)或(b9)或(bl0):(b7)序列表的序列3自N 末端第22至229位氨基酸残基组成的多肽；（b8)序列表的序列3所示的多肽；（b9)将(b7)或 (b8)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽； (blO)与(b7)或(b8)具有90%以上同源性且具有相同功能的多肽。
[0016] 重链可变区的编码基因可为如下（cl)或（c2)或（c3): (cl)序列表的序列1自5'末 端第80-445位所示的DNA分子；（c2)在严格条件下与（cl)限定的DNA序列杂交且编码所述重 链可变区的DNA分子；（c3)与（cl)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述重链可变 区的DNA分子。
[0017] 重链恒定区的编码基因可为如下（c4)或(c5)或(c6):(c4)序列表的序列1自5'末 端第446-1732位所示的DNA分子；（c5)在严格条件下与（c4)限定的DNA序列杂交且编码所述 重链恒定区的DNA分子；（c6)与（c4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述重链恒 定区的DNA分子。
[0018] 重链的编码基因可为如下（c7)或(c8)或(c9)或(cl0):(c7)序列表的序列1自5'末 端第80-1732位所示的DNA分子；（c8)序列表的序列1自5'末端第17-1732位所示的DNA分子； (c9)在严格条件下与（c7)或（c8)限定的DNA序列杂交且编码所述重链的DNA分子；（clO)与 (c7)或(c8)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述重链的DNA分子。
[0019] 轻链可变区的编码基因可为如下（dl)或（d2)或(d3):(dl)序列表的序列1自5'末 端第1841-2155位所示的DNA分子；（d2)在严格条件下与（dl)限定的DNA序列杂交且编码所 述轻链可变区的DNA分子；（d3)与(dl)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述轻链 可变区的DNA分子。
[0020] 轻链恒定区的编码基因可为如下(d4)或(d5)或(d6):(d4)序列表的序列1自5'末 端第2156-2467位所示的DNA分子；（d5)在严格条件下与（d4)限定的DNA序列杂交且编码所 述轻链恒定区的DNA分子；（d6)与(d4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述轻链 恒定区的DNA分子。
[0021] 轻链的编码基因可为如下(d7)或(d8)或(d9)或(dl0):(d7)序列表的序列1自5'末 端第1841-2467位所示的DNA分子；（d8)序列表的序列1自5'末端第1778-2467位所示的DNA 分子；（d9)在严格条件下与（d7)或（d8)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子； (dlO)与(d7)或(d8)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述轻链的DNA分子。
[0022]所述抗体基因可为如下（el)或（e2)或（e3)或（e4)或（e5)或（e6)或（e7)或（e8): (el)具有所述重链的编码基因和所述轻链的编码基因的DNA分子；（e2)序列表的序列1自5' 末端第17-2467位所示的DNA分子；（e3)序列表的序列1自5'末端第11-2467位所示的DNA分 子；（e4)序列表的序列1自5'末端第17-2489位所不的DNA分子；（e5)序列表的序列1自5'末 端第11-2489位所示的DNA分子；（e6)序列表的序列1所示的DNA分子；（e7)在严格条件下与 (el)或（e2)或（e3)或（e4)或（e5)或（e6)限定的DNA序列杂交且编码所述抗体的DNA分子； (e8)与（el)或(e2)或(e3)或(e4)或(e5)或(e6)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码 所述抗体的DNA分子。
[0023]所述新城疫病毒的NP基因具体可如序列表的序列4自5'末端第2852-4321位核苷 酸所示。所述新城疫病毒的P基因具体可如序列表的序列4自5'末端第4617-5804位核苷酸 所示。所述新城疫病毒的M基因具体可如序列表的序列4自5'末端第8522-9616位核苷酸所 示。所述新城疫病毒的F基因具体可如序列表的序列4自5'末端第9776-11437位核苷酸所 示。所述新城疫病毒的HN基因具体可如序列表的序列4自5'末端第11644-13377位核苷酸所 示。所述新城疫病毒的L基因具体可如序列表的序列4自5'末端第13613-20227位核苷酸所 不。
[0024]所述重组质粒pBrClone30_antiIBDVfullAb具体可为如下（f 1)或（f2):
[0025] (fl)具有序列表的序列4中自5末端第2703-20420位核苷酸的质粒；
[0026] (f2)序列表的序列4所示的质粒。
[0027] 所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
[0028] 所述重组新城疫病毒的制备方法包括如下步骤：
[0029] (1)将所述重组质粒 pBrClone3〇-antiIBDVfullAb、pBL_N 质粒、pBL_P 质粒和 pBL_L 质粒共转染BHK-21细胞(每1 X 106个细胞转染lyg重组质粒PBrClone30-antiIBDVfullAb、 0.5yg pBL-N质粒、0.25yg pBL-P质粒和O.lyg pBL-L质粒），置于5%C02、37°C环境中静置 培养72h;
[0030] (2)取步骤（1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于 9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37 °C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有所述重组新 城疫病毒）。
[0031 ]所述重组新城疫病毒的制备方法包括如下步骤：
[0032] (1)将重组质粒 pBrClone3〇-antiIBDVfullAb、pBL_N 质粒、pBL_P 质粒和 pBL_L 质粒 共转染BHK-21细胞(每1 X 106个细胞约转染lyg重组质粒PBrClone30-antiIBDVfullAb、0 ? 5 ygpBL-N质粒、0 ? 25ygpBL-P质粒和0 ? lygpBL-L质粒），置于5 %⑶2、37°C条件中静置培养 72h；
[0033] (2)取步骤(1)得到的转染细胞，于-80°C反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后 接种于9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0034] (3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收 集鸡胚尿囊液；
[0035] (4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收 集鸡胚尿囊液；
[0036] (5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡 胚尿囊液混合，得到混合液，即为重组新城疫病毒病毒液。
[0037]本发明还保护一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA包括如下元件:所述抗体 基因、所述新城疫病毒的NP基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述 新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
[0038]所述重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA中，所述抗体基因位于所述新城疫病毒 的P基因和所述新城疫病毒的M基因之间。
[0039]所述重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA可依次包括如下元件:所述新城疫病毒 的NP基因、所述新城疫病毒的P基因、所述抗体基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫 病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
[0040] 所述的重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA如序列表的序列4中自5末端第 2703-20420位核苷酸所示。
[0041] 本发明还保护一种重组质粒，依次包括如下元件:所述抗体基因、所述新城疫病毒 的NP基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所 述新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因。
[0042] 所述重组质粒中，所述抗体基因位于所述新城疫病毒的P基因和所述新城疫病毒 的M基因之间。
[0043]所述重组质粒可依次包括如下元件:所述新城疫病毒的NP基因、所述新城疫病毒 的P基因、所述抗体基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病 毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
[0044]所述重组质粒具体可为具有序列表的序列4中自5末端第2703-20420位核苷酸的 质粒。所述重组质粒具体可为序列表的序列4所示的质粒。
[0045] 本发明还保护一种重组病毒，其基因组中包括病毒甲的全部基因和编码病毒乙的 抗体的基因。所述病毒甲具体可新城疫病毒。所述病毒乙具体可为鸡传染性法氏囊病毒。所 述病毒乙的抗体可为以上任一所述的鸡IBDV抗体。所述编码病毒乙的抗体的基因可为以上 任一所述的编码鸡IBDV抗体的基因。
[0046] 以上任一所述的重组新城疫病毒或以上任一的所述重组质粒在制备产品中的应 用也属于本发明的保护范围。所述产品的功能如下：作为新城疫病毒和传染性法氏囊病毒 的二价疫苗。所述产品的功能如下：治疗/或预防新城疫病和传染性法氏囊病。所述产品的 功能如下：治疗/或预防鸡新城疫病和鸡传染性法氏囊病。所述鸡新城疫病具体可由F48E9 株引起。所述鸡传染性法氏囊病具体可由BC6/85株或HLJ0504株引起。
[0047] 本发明还保护一种产品，包括以上任一所述的重组新城疫病毒或以上任一的所述 重组质粒。所述产品的功能如下:作为新城疫病毒和传染性法氏囊病毒的二价疫苗。所述产 品的功能如下:治疗/或预防新城疫病和传染性法氏囊病。所述产品的功能如下:治疗/或预 防鸡新城疫病和鸡传染性法氏囊病。所述鸡新城疫病具体可由F48E9株引起。所述鸡传染性 法氏囊病具体可由BC6/85株或HLJ0504株引起。
[0048] 现有疫苗，无论活苗或是死苗，也无论传统疫苗或基因工程疫苗，均只为接种动物 提供主动免疫。现有的二价病毒疫苗的思路如下:将病毒乙的抗原蛋白的编码基因导入病 毒甲减毒株基因组，得到对病毒甲和病毒乙均有效的重组病毒，作为二价病毒疫苗;或者将 病毒乙的抗原蛋白的编码基因导入病毒甲的基因组，得到重组病毒，然后将其灭活，得到对 病毒甲和病毒乙均有效的二价病毒疫苗。本发明中，创造性的用病毒乙的抗体蛋白取代了 病毒乙的抗原蛋白，可以为接种动物同时提供主动免疫和被动免疫，为疫苗构建提供了一 种新思路。本发明提供的疫苗简称为"抗体疫苗"，"抗体疫苗"填补了疫苗不能提供被动免 疫的空白，为疫苗研究开辟了崭新的研究领域。"抗体疫苗"的成功标志着疫苗领域一次新 的技术进步，对我国乃至全世界传染病的预防和治疗起到重要作用。
[0049] 本发明提供的重组新城疫病毒，生长动力学和亲本株Clone30没有明显的差别，接 种SPF鸡后不仅产生抗NDV的HI抗体，而且还表达了抗IBDV的特异性抗体。攻毒实验证明，该 重组新城疫病毒作为新型双价疫苗能同时抵抗NDV和IBDV的攻击。
[0050] 与现有疫苗相比，本发明提供的重组病毒作为疫苗具有如下优点：
[0051 ] (1)与传统二价疫苗不同，对其中一个疫病的免疫原由抗原变成保护性抗体，从主 动免疫变成被动免疫，免疫产生时间提前，从常规2周提前到1天，所以本发明除了适合以体 液免疫为主的传染病外，特别适合发现疫情时的紧急接种。
[0052] (2)抗IBDV抗体是鸡源中和性抗体，扭转了过去被动免疫采取抗血清和卵黄抗体 易造成水平和垂直传播疾病，和应用鼠源单克隆抗体造成异源排斥反应，以及半衰期短的 多年存在的瓶颈问题。
[0053] (3)用疫苗表达动物同源治疗性抗体为应用同源重组抗体治疗动物疾病奠定了理 论基础，同时提供了经济可行的技术手段。
[0054] (4) "抗体疫苗"对目前尚没有疫苗的传染病，致弱困难的病原体，疫苗毒力较强的 病原是最佳代替品。如IBD疫苗，现有IBD疫苗，无论中毒或弱毒均对接种鸡的法氏囊产生一 定程度的破坏，法氏囊是抗体产生的中枢器官，因此法氏囊的破坏对其它疫苗的接种效果 会产生严重的影响，是免疫失败的重要原因之一。本实施例采用ND主动免疫，IBD被动免疫， 避免了接种IBD疫苗破坏鸡法氏囊的瓶颈问题。
[0055] (5)在兽医病原的清除效率方面是我国与先进国家相比最大的差距，究其原因，长 期、大量使用疫苗，特别是弱毒疫苗可能是重要的原因之一。弱毒株在畜禽群体中反复传 代，势必造成疫苗的变异，这些变异株同自然毒在动物群体中形成了庞大的病毒库，加之母 源抗体的干扰，造成了病原清除困难。对重要的病原采取被动免疫，有望切断病原在畜禽群 体中的传播链，有利于最终清除病原。
[0056] (6)近年来，无论人或动物均涌现出很多新的病原或老病原出现超强毒株或变异 株，研制预防这些病原的疫苗需要一定时间。利用已有的疫苗做载体，构建"抗体疫苗"是解 决新病原，或老病原的新变异株的快速方法。
[0057] (7)本动物源抗体的半衰期可达2-3周;抗体产生后可在体内累积，达到保护水平； 见效快，而且持续时间长。
【附图说明】
[0058] 图1为重组质粒pBrClone30_antiIBDVfullAb的元件不意图。
[0059] 图2为重组新城疫病毒增殖稳定性的结果。
[0060]图3为重组新城疫病毒中鸡IBDV中和抗体的表达水平的结果。
[00611图4为在动物水平分别检测NDV抗体和鸡IBDV中和抗体的表达量的结果。
【具体实施方式】
[0062] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0063] 提及 "pBrClone30质粒"的文献："Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase"， ZhengLV，Asian Pac J Cancer Ptev〇
[0064] 提及 "pBL_N质粒"、"pBL_P质粒"和 "pBL_L质粒"的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters?〇
[0065] pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基 因，其中P基因和M基因之间具有SacII和Pmel酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质 粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质 粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组），得到毒株Clone30〇
[0066] BHK-21 细胞:ATCC编号为 CRL-13001。DF-1 细胞:ATCC编号为 CRL-12 203。SPF级白色 来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。完全培养基即为含有10%胎牛 血清的DMEM培养基。
[0067]实施例中所用的IBDV强毒株为BC6/85株，提及该毒株的文献:鸡传染性法氏囊病 病毒队6/85株￥?2基因的原核表达、纯化及鉴定[刀.中国兽药杂志，2015,49(5):17-21.。 [0068] 实施例中所用的新城疫强毒株为F48E9株，提及该毒株的文献:NDV强毒株F48E9:
[0069] 秦智峰，刘建利，卢体康，林庆燕，吕建强，曹琛福等.基于锁核酸探针的双重荧光 实时1^〇?检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株.中国预防兽医学报.2012,34(9):719-723.〇
[0070] 实施例中所用的IBDV超强毒株为HLJ0504株，提及该毒株的文献:高立，祁小乐，高 玉龙，高宏雷，秦立廷，邓小芸，宇文延青，王笑梅.传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ0504全 基因组克隆及其新特征分析.中国预防兽医学报.2010,32(5):401-404.。
[0071] 鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下：（1)在血凝板第一排的1-12孔各加入 25此生理盐水；（2)在第1孔中加入25此待测病毒液，混匀后吸25此到第2孔，如此倍比稀释 直到第10孔，第10孔混匀后弃除25yL; (3)在1-12孔中各加入25yL 1%鸡血红细胞；（4)震荡 后室温静置20-30min，观察结果。
[0072]鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下：（1)在血凝板的1-12孔各加入25y L生理盐水；（2)第1孔加入待检血清25此，混匀后吸25此至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第 10孔混匀后弃除25yL;(3)在1-12孔中各加入25yL实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝 单位），室温静置30min;(4)在1-12孔中各加入25此1%鸡血红细胞；（5)震荡后室温静置 30-40min，观察结果。
[0073]原核表达载体pSUMO(在文献中被称为"pHisSUMO"）：参考文献:姜媛媛，尹成凯，李 晋南，任桂萍，张薇，李德山.利用SUM0融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业 大学学报，2008，39 (10): 57-62 ;李璐，尹成凯，李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载 体--pHisSUMO?生物技术，2009,19(3): 11-14.。
[0074] 大肠杆菌Rosetta(DE3):北京全式金生物技术有限公司，目录号:CD801。
[0075] SUM0蛋白酶I (具有His标签）：制备方法见文献:傅俊华，王琪，尹杰超，刘铭瑶，李 宁，姚文兵，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大肠杆菌中的高效可溶性表达及 其活性鉴定.生物工程学报，2010，26(6): 837-842.。
[0076] 实施例1、试验准备
[0077] 一、制备传染性法氏囊病毒的VP2蛋白
[0078] 1、将序列表的序列6所示的双链DNA分子(序列表的序列6所示的双链DNA分子为 VP2蛋白的编码基因，编码序列表的序列5所示的VP2蛋白）插入原核表达载体pSUMO的BamHI 和Bbs頂每切位点之间，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分 子伴侣SUM0的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列(位于SUM0的编码序列的上 游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次 为His标签、分子伴侣SUM0和VP2蛋白）。
[0079] 2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
[0080] 3、将步骤2得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C、 120rpm振荡培养至0D_r?为0.3左右。
[0081] 4、完成步骤3后，向培养体系中加入IPTG并使其浓度为0.4mmol/L以进行诱导（25 °C、65rpm振荡培养10h)，然后4°C、4000rpm离心30min，收集菌体。
[0082] 5、取步骤4得到的菌体，用Binding Buffer重悬，加入购自Amresco的溶菌酶溶液 并使溶菌酶的浓度为lmg/ml，4°C放置lh，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、 12000rpm离心，收集上清液。
[0083] 6、取步骤5得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
[0084] 柱子型号为:柱长0 ? 7cm，柱高2 ? 5cm。上样量为10ml 〇
[0085]洗脱过程:先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质： 40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3P〇4;pH7.4)洗脱以去除杂蛋白，流速为lml/ min;然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液(溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质:500mmo 1 /L 咪挫、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3P〇4;pH7.4)洗脱，流速为lml/min，280nm波长监测，收 集目标峰(即峰值高于80mAU的峰），即为融合蛋白溶液。
[0086] 7、采用HiPrepTM 26/10Desalting将步骤6得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
[0087] 8、取步骤7得到的溶液，用SUM0蛋白酶I (SUM0蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1: 50)和终浓度为2mmol/L的DTT 4°C切割过夜。
[0088] 9、取步骤8得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
[0089] 柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
[0090] 上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为VP2蛋 白溶液。
[0091]回收目的带并进行N端测序，结果表明，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列5自 N末端第1至15位氨基酸残基所示。
[0092] 二、制备真核表达的鸡IBDV中和抗体
[0093] 1、采用Peel2.4载体作为表达载体，插入序列表的序列1自5'末端第1841-2467位 核苷酸所示的双链DNA分子，得到重组质粒。
[0094] 2、采用Pee6.4载体作为表达载体，插入序列表的序列1自5 '末端第80-1732位核苷 酸所示的双链DNA分子，得到重组质粒。
[0095] 3、将步骤1得到的重组质粒和步骤2得到的重组质粒均用Notl和Sail双酶切，选择 大片段相连，构建出具有双顺反子的真核重组表达载体，转染CH0-K1SV细胞，得到重组细 胞。
[0096] 4、培养步骤3得到的重组细胞，收集细胞培养上清，得到真核表达的鸡IBDV中和抗 体。
[0097]实施例 2、rClone30-antiIBDVfullAb 病毒液的制备
[0098] 一、重组质粒的构建
[0099] 1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
[0100] 序列表的序列1中，第1-6位为SacII酶切位点序列，第11-16位为Kozac序列，第17- 79位为H链的信号肽，第80-445位为H链的可变区，第446-1732位为H链的恒定区。第1733-1738位为Spel酶切位点序列，第1742-1747位为Mlu頂每切位点，第1748-1769位为GEGS序列， 第1772-1777位为Kozac序列，第1778-1840位为L链的信号肽，第1841-2155位为L链的可变 区，第2156-2467位为L链的恒定区。第2468-2489位为GEGS序列，第2490-2497位为Pmel酶切 位点序列。
[0101] 序列表的序列1所示的DNA分子表达鸡IBDV中和抗体。鸡IBDV中和抗体的H链如序 列表的序列2所示。鸡IBDV中和抗体的L链如序列表的序列3所示。序列表的序列2中，第1至 21位氨基酸残基组成信号肽，第22至143位氨基酸残基组成重链可变区，第144至571位氨基 酸残基组成重链恒定区。序列表的序列2中，第1至21位氨基酸残基组成信号肽，第22至126 位氨基酸残基组成轻链可变区，第127至229位氨基酸残基组成轻链恒定区。
[0102] 2、采用限制性内切酶Sac II和Pmel双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0103] 3、采用限制性内切酶Sacn和Pmel双酶切pBrClone30质粒，回收约16000bp的载体 骨架。
[0104] 4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒口8"1〇11630- antilBDVfullAb。
[0105] 经测序，重组质粒PBrClone30-antiIBDVfullAb的核苷酸序列如序列表的序列4所 示。序列表的序列4中，自5末端第2703-20420位核苷酸为rClone30-antiIBDVfullAb病毒 的基因组。序列表的序列4中，自5末端第2852-4321位核苷酸为新城疫病毒的NP基因、第 4617-5804位核苷酸为新城疫病毒的P基因、第5999-8495位核苷酸为序列表的序列1所示的 核苷酸、第8522-9616位核苷酸为新城疫病毒的M基因、第9776-11437位核苷酸为新城疫病 毒的F基因、第11644-13377位核苷酸为新城疫病毒的HN基因、第13613-20227位核苷酸为新 城疫病毒的L基因。
[0106] 重组质粒pBrClone30_antiIBDVfullAb的元件不意图见图1。
[0107] 二、重组病毒的制备
[0108] 1、将重组质粒 PBrClone30-antiIBDVfullAb、pBL-N 质粒、pBL-P 质粒和 pBL-L 质粒 共转染BHK-21细胞(每1 X 106个细胞约转染lyg重组质粒PBrClone30-antiIBDVfullAb、0 ? 5 ygpBL-N质粒、0 ? 25ygpBL-P质粒和0 ? lygpBL-L质粒），置于5 %⑶2、37°C条件中静置培养 72h〇
[0109] 2、取步骤1得到的转染细胞，于-80°C反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接 种于9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收集鸡胚尿囊液。
[011 0] 3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收集 鸡胚尿囊液。
[0111] 4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37 °C培养72h，收集 鸡胚尿囊液。
[0112] 5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊 液混合，得到混合液。混合液的HA效价为1024。
[0113] 将步骤5得到的混合液命名为rClone30-antiIBDVfullAb病毒液。
[0114] 三、对照病毒的制备
[0115] 用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30_antiIBDVfullAb进行步骤二的1至 5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
[0116] 实施例3、重组新城疫病毒增殖稳定性
[0117] 分别将实施例2制备的rClone30病毒液或rClone30-antiIBDVfullAb病毒液按 0.謂01感染六孔板内汇合度为80%-90%的单层0?-1细胞，置于5%0) 2、37°(：环境中静置培 养96h。分别于培养24h、48h、72h和96h时取上清，米用Reed-Muench法计算每毫升重组病毒 的 TCIDso。
[0118] 结果见图2，rClone30-antiIBDVfullAb病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴 度。结果表明，序列1所示DNA分子的插入并不影响rCl 〇ne30病毒的增殖能力。
[0119] 实施例4、重组新城疫病毒中鸡IBDV中和抗体的表达水平
[0120] 分别将实施例2制备的rClone30病毒液或rClone30-antiIBDVfullAb病毒液进行 如下步骤：
[0121] 1、将处于对数生长期的BHK-21细胞接种至150cm2细胞培养瓶中，分组处理(试验 组：以0.1M0I的剂量感染实施例2制备的病毒液，病毒液用完全DMEM培养基稀释；阴性对照 组：用等体积PBS缓冲液代替实施例2制备的病毒液），37 °C静置孵育lh，然后用完全培养基 洗涤三遍。
[0122] 2、完成步骤1后，取所述细胞培养瓶，加入含lyg/mL胰蛋白酶的完全培养基并置于 5 % C02、37 °C环境中静置培养48h。
[0123 ] 3、完成步骤2后，取所述细胞培养瓶，反复冻融3次，收集上清液。
[0124] 4、取步骤3得到的上清液，浓缩至十分之一体积，得到浓缩液。
[0125] 5、取步骤4得到的浓缩液，进行SDS-PAGE。结果见图3A(方框标注目的条带）。
[0126] 6、取步骤4得到的浓缩液，进行Dot blot。
[0127] Dot blot的具体步骤如下：
[0128] (1)将传染性法氏囊病毒的VP2蛋白点在硝酸纤维素膜上，然后用含5g/100mL脱脂 奶粉的PBST溶液进行封闭（37 °C封闭3h)。
[0129] (2)完成步骤(1)后，取硝酸纤维素膜，用PBST溶液洗涤三次(每次5min)。
[0130] (3)完成步骤(2)后，取硝酸纤维素膜，分组处理(试验处理:浸没于试验组步骤4得 到的浓缩液；阴性对照处理:浸没于阴性对照组步骤4得到的浓缩液；阳性对照处理:浸没于 真核表达的鸡IBDV中和抗体），37 °C孵育1 h。
[0131] (4)完成步骤(3)后，取硝酸纤维素膜，用PBST溶液洗涤5次(每次lOmin)。
[0132] (5)完成步骤(4)后，取硝酸纤维素膜，浸没于HRP标记的兔抗鸡的二抗(工作浓度 为1:7500稀释度），37°C孵育45min。
[0133] (6)完成步骤(5)后，取硝酸纤维素膜，用PBST溶液洗涤5次(每次1 Omin)。
[0134] (7)完成步骤(6)后，取硝酸纤维素膜，在ECL曝光仪进行曝光。
[0135] 结果见图3B。结果表明，rClone30-antiIBDVfullAb能稳定表达鸡IBDV中和抗体， rClone30不表达鸡IBDV中和抗体，BHK-21细胞不表达鸡IBDV中和抗体。
[0136] 实施例5、在动物水平分别检测NDV抗体和鸡IBDV中和抗体的表达量
[0137] 取1日龄白色来航鸡，随机分为3组，每组10只，分别处理如下(均为单次免疫）：
[0138] 第一组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200yl实施例2制备rClone30-antilBDVfullAb病毒液(rClone30-antiIBDVfullAb病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的 病毒液的浓度为10 5TCID5Q/0. lml);
[0139] 第二组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200yl实施例2制备rClone30病毒液 (rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10 5TCID5Q/0.1ml);
[0140] 第三组:每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200yl生理盐水。
[0141] 分别于免疫前和免疫后7d翅静脉采血分离血清，作为待测血清，检测NDV抗体的HI 效价和鸡IBDV中和抗体的表达量。
[0142] 检测IBDV全长抗体的表达量的方法如下(ELISA方法）：
[0143] (1)取96孔板，将传染性法氏囊病毒的VP2蛋白溶液(溶剂为包被缓冲液，传染性法 氏囊病毒的VP2蛋白的包被浓度为10μg/ml)作为包被原，4°C包被过夜。包被缓冲液： 0? 159gNa2C03、0? 293g NaHC03，溶于 100ml的蒸馏水。
[0144] (2)完成步骤⑴后，取96孔板，弃上清，加入含5g/100mL脱脂奶粉的PBST溶液进行 封闭（37°C封闭2h)。
[0145] (3)完成步骤(2)后，取96孔板，弃上清，用PBST溶液洗涤三次。
[0146] (4)完成步骤(3)后，取96孔板，加入作为一抗的待测血清稀释液(用5g/100ml脱脂 奶水溶液将待测血清稀释至50倍体积），37 °C孵育lh。
[0147] (5)完成步骤(4)后，取96孔板，弃上清，用PBST溶液洗涤五次。
[0148] (6)完成步骤(5)后，取96孔板，加入HRP标记的兔抗鸡的二抗（1:7500倍稀释），37 °C 孵育 45min。
[0149] (7)完成步骤(6)后，取96孔板，弃上清，用PBST溶液洗涤五次。
[0150] (8)完成步骤（7)后，取96孔板，加入的底物液，37避光反应15min。底物液:A液： 2. lg的Na2HP〇4溶于100ml蒸馏水;B液：7.163g梓檬酸溶于100ml蒸馏水;C液：lOmgTMB溶于 5ml无水乙；4.86mlA液、5.14ml B液、0. lmlC液和0.01ml双氧水混合，得到底物液。
[0151 ] (9)完成步骤(8)后，取96孔板，加入终止液(是2M硫酸溶液）。
[0152] (10)完成步骤(9)后，取96孔板，放在酶标仪上，450nm处读出0D值。
[0153] 结果见图4。结果表明：rClone30免疫SPF鸡之后，鸡的NDV抗体水平显著升高(**P〈 0.01)，而鸡IBDV中和抗体水平没有明显变化;rClone30-antiIBDVfullAb免疫SPF鸡之后， NDV抗体(#P〈0.01)和鸡IBDV中和抗体(*P〈0.05)的水平均显著升高。
[0154] 实施例6、攻毒实验
[0155] 取1日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只，分别处理如下：
[0156] 第一组(rClone30-antiIBDVfullAb组）：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用 滴鼻点眼的方式免疫200yl实施例2制备rClone30-antiIBDVfullAb病毒液（rClone30-antiIBDVfullAb病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10 7TCID5()/0.1ml)。
[0157] 第二组(rCl〇ne30组）：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免 疫200yl实施例2制备rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病 毒液的浓度为l〇 7TCID5Q/0. lml)。
[0158] 第三组(攻毒组）：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200yl生理盐水。
[0159] 第四组(健康组）：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200iil生理盐水。
[0160]试验第22天，除了健康组之外，其余三组采用IBDV强毒株进行攻毒（每只鸡采用 104ELD5Q的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0. lml)。试验第25天，全部进行扑杀，称量 鸡的体重和法氏囊重量，计算囊重比指数。
[0161] 结果见表1。结果表明，相比rClone30组的囊重比指数，rClone30-antiIBDVfullAb 组的囊重比指数更接近健康组的囊重比指数。
[0162] 表1
[0164] 实施例7、重组二联苗对鸡的免疫保护试验
[0165] 取1日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组30只，分别处理如下：
[0166] 第一组(rClone30-antiIBDVfullAb组）：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用 滴鼻点眼的方式免疫200yl实施例2制备rClone30-antiIBDVfullAb病毒液（rClone30-antiIBDVfullAb病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10 7TCID5()/0.1ml)。
[0167] 第二组(rCl〇ne30组）：试验第1天、第7天和第21天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免 疫200yl实施例2制备rClone30病毒液(rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病 毒液的浓度为l〇 7TCID5Q/0. lml)。
[0168] 试验第22天:每组取10只，采用新城疫强毒株进行攻毒(每只鸡采用104ELD 5Q的剂 量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml);每组取另外10只，采用IK)V超强毒株进行攻毒 (每只鸡采用l〇 4ELD5Q的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml);每组取剩下的10只， 同时采用新城疫强毒株和IBDV超强毒株进行攻毒(每只鸡经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积 为0.1ml，两种病毒的攻毒剂量均为10 4ELD5Q)。试验第25天，观察各组鸡的发病率和死亡率。
[0169] 结果见表2。结果表明，分别使用NDV和IBDV强毒株攻毒时^(：1〇11630-&拉1180￥如11413组的发病率和死亡率低于"1〇11630对照组，对鸡产生有效的免疫保护。
[0170] 表2
【主权项】
1. 一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒？8"1〇1^30-ant i IBDVful lAb、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所 述重组新城疫病毒； 所述重组质粒pBrClone3〇-anti IBDVful lAb中包括如下元件:抗体基因、新城疫病毒的 NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的Μ基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基 因和新城疫病毒的L基因；所述抗体基因为病毒抗体。2. 如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于:所述抗体基因位于所述新城疫病 毒的Ρ基因和所述新城疫病毒的Μ基因之间。3. 如权利要求2所述的重组新城疫病毒，其特征在于:所述病毒抗体为鸡IKW抗体。4. 一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA包括如下元件:抗体基因、新城疫病毒的 NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的Μ基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基 因和新城疫病毒的L基因；所述抗体基因为病毒抗体。5. 如权利要求4所述的重组新城疫病毒，其特征在于:所述抗体基因位于所述新城疫病 毒的Ρ基因和所述新城疫病毒的Μ基因之间。6. 如权利要求6所述的重组新城疫病毒，其特征在于:所述病毒抗体为鸡IKW抗体。7. -种重组质粒，依次包括如下元件:抗体基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P 基因、新城疫病毒的Μ基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基 因；所述抗体基因为病毒抗体。8. -种重组病毒，其基因组中包括病毒甲的全部基因和编码病毒乙的抗体的基因。9. 权利要求1至6中任一所述的重组新城疫病毒，或，权利要求7所述重组质粒，在制备 产品中的应用;所述产品的功能如下:作为新城疫病毒和传染性法氏囊病毒的二价疫苗。10. -种产品，包括权利要求1至6中任一所述的重组新城疫病毒或权利要求7所述的重 组质粒;所述产品的功能如下:作为新城疫病毒和传染性法氏囊病毒的二价疫苗。
【文档编号】A61K39/17GK105821010SQ201610308119
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】李德山, 何金娇, 尹杰超, 任桂萍
【申请人】哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司