一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用，该菌株分类命名为阿氏芽孢杆菌<i>Bacillus aryabhattai</i>，编号为BPR078，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11971。本发明的蓝莓根际促生阿氏芽孢杆菌制成菌剂后接种到蓝莓扦插苗，可明显加速蓝莓生根，促进扦插苗生长，与对照相比，差异达到显著水平。因此，本发明为将来开发蓝莓专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源。CGMCC No.1197120160107
【专利说明】
一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 蓝莓(Vacciniumssp.L.)果实颜色艳丽，风味独特，含有大量的蛋白质、脂肪、维生 素、果胶物质、S0D、黄酮、钾、磷、钙等丰富的营养成分;含有大量的天然色素，且经研究发现 在多种水果中，其色素含量最高，已成为保健药物的原料。
[0003] 植物根际促生细菌是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有 拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用。据不完全统计，已发 现包括假单胞菌和芽抱杆菌等20多个属的植物根际促生细菌具有防病促生潜能的报道。植 物根际促生细菌可分泌植物促生物质，包括植物激素、维生素、氨基酸和其它活性有机小分 子及衍生物等;还可改善植物根际的营养环境，有效控制植物病害等。
[0004] 本发明人已从蓝莓根际土壤中筛选出了蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌L13(保藏编 号为CGMCC No.7068)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)L5(保藏编号为CGMCC No.7667)， 能适应蓝莓特定的根际土壤环境，并能促进蓝莓生长。
[0005] 蓝莓为浅根系，无根毛，根系多分布于浅层土壤中，生长环境较为特殊，常用的功 能微生物接种到蓝莓土壤中，难以存活和定殖，无法产生持续、稳定的功效，基于以上原因， 适宜蓝莓的PGPR菌株资源十分匮乏，继续丰富蓝莓菌株资源，对改善蓝莓根系的微生态环 境、促进蓝莓生长、改善蓝莓品质具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株蓝莓专用的根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用，该菌株能 适应蓝莓特定的根际土壤环境，并能促进蓝莓生长。
[0007] 本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明的第一个目的是提供一株阿氏芽孢杆菌，该菌株的分类命名为阿氏芽孢杆 菌Bacillus aryabhattai，编号为BPR078,已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 11971。
[0009] 菌落特征及菌体形态：
[0010]在LB培养基上菌落形态为圆形规则，且菌落较大，培养24h菌落大小约为2-4.5mm， 表面凸起，较湿润，微黄色，不透明，镜检菌体较大，杆状，有芽孢。
[0011] 生理生化特征：
[0012] 柠檬酸盐（西蒙氏）试验阳性，脲酶试验阳性，棉籽糖试验阳性，L-鼠李糖试验阴 性，氧化酶(Ko vacs)试验阴性，伏-普试验阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，0NPG试验 阳性，赖氨酸脱羧酶试验阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，卫矛醇试验阴性。
[0013] 功能定性及定量测定：
[0014]本发明的菌株能够产蛋白酶，于干酪素培养基中培养48h产生透明圈直径D为 16mm，菌落直径d为6.1mm，D/d为2.62，定量测定发酵液中蛋白酶酶活为52.895μg/ml。
[0015]利用美国Waters高效液相色谱仪515型，Waters2487双波长紫外检测器测定发酵 液有机酸种类及含量。色谱条件为色谱柱：美国Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流动相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸调pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);检测波长:210nm，灵敏度： 0.5AUFS，进样量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱温：28°C。检测结果显示，BPR078产草酸浓度为 452.36μg/ml，产乙酸浓度为9542μg/ml，产柠檬酸浓度为3865μg/ml。
[0016] 本发明的第二个目的是提供一种微生物混合物，其特点是至少包含本发明的菌 株，所述微生物混合物可以包含其他具有促进植物生长(特别是促进蓝莓生长)并与本发明 的菌株共生的微生物。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品， 该产品可以是菌剂或组合物等形式。
[0018] 优选的，所述产品包括载体;所述载体可以为固体载体或液体载体。所述固体载体 或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白 碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液体载体可以为植物油、矿物油或水。
[0019] 优选的，所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、片剂形式、颗粒形式或其他 形式。
[0020] 进一步优选的，所述粉末形式可以为冻干粉末形式;所述片剂形式为含有所述冻 干粉末和任选营养素(例如维生素、矿物盐等)的片剂形式。
[0021 ] 所述产品的活性成分为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BPR078，该活性成 分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的 形式存在。
[0022] 本发明的第四个目的是保护本发明的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai) BPR078发酵液。
[0023] 本发明的第五个目的是提供一种本发明的菌株、本发明的微生物混合物或者本发 明的包含本发明菌株或本发明微生物混合物的产品在促进植物生长中的应用，所述植物具 体为蓝莓。
[0024]本发明的菌株可促进蓝莓扦插苗生根，促进蓝莓生长，并可提高蓝莓根际土壤中 蛋白酶和蔗糖酶的活性。
[0025]本发明的第六个目的是提供一种促进蓝莓生长的方法，该方法包括使需要生长的 蓝莓的根际周围环境与本发明的菌株-阿氏芽孢杆菌(Baci 1 lus aryabhattai)BPR078接触 的步骤。
[0026]优选的，所述蓝莓的根际周围环境为蓝莓根际土壤。
[0027] 优选的，使需要生长的蓝莓的根际周围环境与本发明的菌株-阿氏芽孢杆菌 (Baci 1 lus aryabhattai )BPR078接触的步骤在于：用本发明的菌株-阿氏芽孢杆菌 (Bacillus aryabhattai)BPR078接种需要生长的蓝莓根际土壤中。
[0028] 本发明的有益效果是:本发明的蓝莓根际促生阿氏芽孢杆菌接种到蓝莓扦插苗， 可明显加速蓝莓生根，促进扦插苗生长，并可提高蓝莓根际土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性， 与对照相比，差异达到显著水平。因此，本发明为将来开发蓝莓专用的微生物肥料提供了优 良的菌株资源。
【附图说明】
[0029] 图1是本发明菌株的菌落形态图。
[0030] 图2是本发明菌株的光学显微镜镜检图。
[0031] 图3是采用本发明菌株的发酵液的蓝莓组培苗和对照组的蓝莓组培苗对比照片。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1本发明阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BPR078的筛选
[0033] (1)筛选过程
[0034]在青岛胶南佳沃蓝莓种植基地不同大棚内采集蓝莓根际土壤样品3个。通过梯度 稀释法，从根际土样中分离出细菌分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通 过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备 用。
[0035]向含有L-色氨酸的R2A液体培养基中接菌，28°C，180rpm，摇床培养4d。取50微升菌 悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入50微升Salkowski比色液（50ml 35%HCL〇4+lmlO ? 5mol/L FeCl3)。将加入50mg/L IAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观 察，颜色变红者表示能够分泌IAA，初筛出分泌IAA的细菌。
[0036]对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，继续筛选具有应用潜力的根际促生 细菌。最后通过蓝莓的盆栽实验，确定一株促进蓝莓生长效果最好的细菌，编号为BPR078。 [0037] (2)菌落特征及菌体形态
[0038]如图1和图2所示，在LB培养基上菌落形态为圆形规则，且菌落较大，培养24h菌落 大小约为2-4.5mm，表面凸起，较湿润，微黄色，不透明，镜检菌体较大，杆状，有芽孢。
[0039] (3)生理生化特征
[0040]柠檬酸盐（西蒙氏）试验阳性，脲酶试验阳性，棉籽糖试验阳性，L-鼠李糖试验阴 性，氧化酶(Ko vacs)试验阴性，伏-普试验阴性，甲基红试验阴性，吲哚试验阴性，0NPG试验 阳性，赖氨酸脱羧酶试验阴性，鸟氨酸脱羧酶试验阴性，卫矛醇试验阴性。
[0041] (4)功能定性及定量测定
[0042]菌株能够产蛋白酶，于干酪素培养基中培养48h产生透明圈直径D为16mm，菌落直 径d为6.1mm，D/d为2.62，定量测定发酵液中蛋白酶酶活为52.895μg/ml。
[0043]利用美国Waters高效液相色谱仪515型，Waters2487双波长紫外检测器测定发酵 液有机酸种类及含量。色谱条件为色谱柱：美国Thermo Hypersil GOLD aQ 250X4.6mm， 5u;流动相：10mmoLNH4H2P〇4(磷酸调pH=2.3):甲醇= 98:2(V:V);检测波长:210nm，灵敏度： 0.5AUFS，进样量：lOuL，流速:0.8mL/min，柱温：28°C。检测结果显示，BPR078产草酸浓度为 452.36μg/ml，产乙酸浓度为9542μg/ml，产柠檬酸浓度为3865μg/ml。
[0044] (5)16S rDNA序列分析
[0045] 本发明菌株的16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列与 GenBank数据库中的序列比对。
[0046] BPR078系统发育树中同阿氏芽抱杆菌(Bacillus aryabhattai)处于同一分枝，其 16S rDNA序列与阿氏芽孢杆菌(Baci 1 lus aryabhattai)的相似性达98 ? 77%。结合菌落形 态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，将本发明的菌株BPR078鉴定为阿氏芽孢杆菌 (Bacillus aryabhattai)〇
[0047]实施例2对蓝莓生长具有促生作用
[0048]将保存在斜面上的BPR078用三区划线的方法活化在LB (蛋白胨10g; NaCl 10g;酵 母浸膏58;琼脂15-2(^;水100〇1111$117.〇-7.2，分装，121<€灭菌2〇111；[11)平板上。挑取单菌落 至相应的l0ml液体培养基中，37°C，180rpm培养24h。按1 %接种量将种子液接种至相应的 50ml液体培养基中进行发酵，37°C，180rpm培养2d安排蓝莓组培苗的穴盘苗试验。
[0049] 穴盘苗试验于2015年4月30青岛沃林蓝莓生产基地进行，选用蓝莓组培苗，，每个 穴盘为1个处理，扦插200棵组培苗。每个处理施加100mL促生菌发酵液，稀释至1000mL均匀 浇灌，正常管理，2015年7月30取样调查，结果如下表1~3和图3所示。可以看出，接种BPR078 可促进蓝莓扦插苗生根，促进蓝莓生长，并可提高蓝莓根际土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。 由此可见，BPR078在蓝莓栽培种具有很大的应用潜力。
[0050]表1营养钵苗试验植株生长指标
[0052]表2营养钵苗试验植株生物量
[0054]表3营养钵苗试验土壤酶活测定
[0056] 实施例3
[0057] -种微生物混合物，其特点是包含本发明的菌株阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai )BPR078，还包含其他微生物，所述其他微生物为促进蓝莓生长并与阿氏芽孢 杆菌(Bacillus aryabhattai)BPR078不产生诘抗作用的微生物。经过实验验证，该微生物 混合物明显促进蓝莓扦插苗生根，促进蓝莓生长，并可提高蓝莓根际土壤中蛋白酶和蔗糖 酶的活性。
[0058] 实施例4
[0059] -种包含本发明菌株或本发明微生物混合物的菌剂，菌剂中包括载体和该本发明 所述的菌株-阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BPR078,所述载体可以为固体载体或 液体载体。所述固体载体或液体载体均为常规的载体材料，其中，固体载体可以选自粘土、 滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石、玉米粉、豆粉、聚乙烯醇和/或聚二醇;液体载体可 以为植物油、矿物油或水。菌剂的形式为冻干粉末形式。经过实验验证，该菌剂以阿氏芽孢 杆菌(Bacillus aryabhattai)BPR078为活性成分，可以促进蓝莓扦插苗生根，促进蓝莓生 长，并可提高蓝莓根际土壤中蛋白酶和蔗糖酶的活性。
【主权项】
1. 一株阿氏芽孢杆菌，其特征是：该菌株分类命名为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai，编号为BPR078，已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 11971。2. -种微生物混合物，其特征是:至少包含权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌。3. 包含权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物混合物的产品。4. 如权利要求3所述的产品，其特征是:所述产品为粉末形式、溶液形式、悬浮剂形式、 片剂形式、颗粒形式或其他形式。5. 包含权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌的发酵液。6. 权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物混合物或权利要求3所述 的产品或权利要求5所述的发酵液在促进植物生长中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征是:所述植物为蓝莓。8. 如权利要求7所述的应用，其特征是:接种权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌或权利要 求2所述的微生物混合物或权利要求3所述的产品或权利要求4所述的发酵液能提高蓝莓根 际土壤中的蛋白酶和蔗糖酶的活性。9. 一种促进蓝莓生长的方法，其特征是：该方法包括使需要生长的蓝莓的根际周围环 境与权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌接触的步骤。10. 如权利要求9所述的方法，其特征是，使需要生长的蓝莓的根际周围环境与权利要 求1所述的阿氏芽孢杆菌接触的步骤在于:采用权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌接种需要生 长的蓝莓的根际土壤中。
【文档编号】A01N63/02GK105820986SQ201610368365
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】杜秉海, 马海林, 丁延芹, 刘方春, 姚良同, 杜振宇, 范玲超, 马丙尧, 徐文凤, 李丽
【申请人】山东省林业科学研究院