一种简易快速的蛋白质分离纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，包括如下步骤：在透析管中添加亲和层析填料，用Buffer 1平衡，将待分离蛋白溶液添加到透析管中，混匀数次，静置或慢速离心；将收集液同样反复处理三到四次；用Buffer 2洗脱杂蛋白；用Buffer 3将目的蛋白洗脱下来；将收集得到的蛋白溶液，进行SDS?PAGE电泳检测；亲和层析填料用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20％乙醇溶液液封，置于4℃层析柜保存备用。本发明能够快速有效地去除杂蛋白，富集目标蛋白；提高了蛋白质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质的损失；操作简便，设备均可回收重复使用。
【专利说明】
一种简易快速的蛋白质分离纯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及蛋白质分离领域，具体涉及一种简易快速的蛋白质分离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的 细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋 白质的分离纯化是一项复杂的工作。蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从缓冲溶液 中分离纯化出某种目的蛋白的方法，在蛋白质工程和分子生物学中应用广泛，为研究蛋白 质结构与功能打下了坚实基础。现有蛋白质分离纯化技术主要包括:沉淀法、吸附层析、离 子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、聚焦层析、气相色谱、高效液相色谱等方法。但到目前为 止，还没有一套通用现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，并且蛋 白质分离纯化技术过程复杂，需要多种设备配合，提取效率低，可批次间稳定性差，仅可用 于蛋白质的实验室研究，而无法达到规模生产要求。
[0003] 为了提高蛋白质分离纯化的效果，提高提纯率、提纯产量和提取稳定性，出现了具 有高度集成的蛋白质分离纯化设备，这些设备的可重复好，提取效率高。但是，这些蛋白质 分离纯化的设备大都非常昂贵（如AKTA分离纯化系统），耗时较长，对于科研经费紧张的科 研院所与企业不易大量的推广。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，该方法无 需昂贵的蛋白质分离纯化设备即可进行带有组氨酸的蛋白以及多肽的分离纯化工作。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] 本发明提供一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，包括如下步骤：
[0007] S1、在透析管中均匀添加一定量的亲和层析填料，用Buffer 1平衡后，将待分离蛋 白溶液缓慢添加到透析管中，上下颠倒混匀数次，静置使溶液缓慢流下或2000rpm慢速离 心；
[0008] S2、将步骤S1收集管得到的溶液重新倒回分离管中，上下颠倒混匀数次，静置，如 此反复三到四次；
[0009] S3、将步骤S2最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 2洗脱杂蛋白； [0010] S4、将步骤S3最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 3将目的蛋白 洗脱下来；
[0011] S5、取步骤S4收集管收集的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳检测；
[0012] S6、纯化之后用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20 %乙醇溶液液封，置于4 °C层析柜保存备用。
[0013] 优选地，所述亲和层析填料为镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)。
[0014] 优选地，所述Buffer 1包含以下组分：
[0015] 20mmol/L Tris.base，300mmol/L NaCl，15mmol/L imidazole，lmmol/U3-ME，溶液 终浓度为pH 8.0。
[0016] 优选地，所述Buffer 2包含以下组分：
[0017] 20mmol/L Tris. base, 50mmol/L NaCl, 15mmol/L imidazole，lmmol/L0-ME，溶液 终浓度为pH 8.0。
[0018] 优选地，所述Buffer 3包含以下组分：
[0019] 20mmol/L Tris .base，50mmol/L NaCl，150mmol/L imidazole，lmmol/U3-ME，溶液 终浓度为pH 8.0。
[0020] 优选地，所述Buffer 4包含以下组分：
[0021] 20mmol/L Tris?base，200mmol/L NaCl，250mmol/L imidazole，lmmol/L EDTA， lmmol/LP-ME，溶液终浓度为pH 7.5。
[0022] 本方法可选择型的纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽。
[0023]本发明优点在于：
[0024] 本发明提供一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，通过填装镍离子金属鳌合亲和 层析介质，以及经过不同缓冲液的洗脱，能够快速去除杂蛋白，富集目标蛋白；提高了蛋白 质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质的损失;该方法能够一次性处理lg_500g带有组氨 酸的蛋白或多肽的大肠杆菌，达到电泳纯(>95%)，根据表达的可溶性外源蛋白的量，纯化 的外源蛋白产量可达到l〇mg至10g蛋白。该方法操作简便，材料可回收重复使用，节约资源。 该方法可用于所有使用镍离子金属鳌合亲和层析介质的含有多个组氨酸的蛋白以及多肽。
【附图说明】
[0025] 图1为MDM2蛋白结构不意图。
[0026] 图2为pET_28a( + )的质粒图谱。
[0027]图3为本发明提供的简易快速的蛋白质分离纯化方法的提纯的MDM2蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明的分离纯化优势更加明确，结合以下实施例对本发明进行进一步详 细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0029]本发明所用Ni-NTA琼脂糖购自武汉金益肽生物有限公司，货号JYT-M0007。
[0030]本发明所用其他试剂均为分析纯。
[0031]人类MDM2蛋白含有491个氨基酸，可以分成:N末端p53结合区，中央酸性区，锌指区 域和C末端RING指，如图1所示(聂海祺等，2006)。其N末端p53结合区和C末端RING区是p53泛 素化和出核所必需的（Boyd,S.D.，Tsai,K.Y.，and Jacks，T.2000.An intact HDM2RING-finger domain is required for nuclear exclusion of p53.Nat.Cell Biol.2:563-568.；Honda,R.and Yasuda,H.2000.Activity of MDM2,a ubiquitin 1igase,toward p53or itself is dependent on the RING finger domain of the ligase.Oncogene 19:1473-1476.)。其中，中央酸性区和锌指结构与许多调节MDM2功能的蛋白质相结合。为了 获得表达MDM2蛋白的大肠杆菌，将与MDM2功能蛋白质相结合的锌指结构和部分中央酸性区 域(第250-402位氨基酸），序列见SEQ ID No.2的DNA编码序列（见SEQ ID No. 1)克隆到如图 2所示的带有组氨酸标签(组氨酸标签的编码序列位于载体的第270-287位）的表达质粒载 体pET-28a( + )的克隆位点Ndel和BamHl之间，得到表达载体pET28a-MDM2,然后将该表达载 体转化到大肠杆菌(E.coli)DH5a中，对鉴定转化成功的大肠杆菌菌株进行扩增，获得用于 表达大肠杆菌的菌体。上述所采用的方法均为分子生物学领域常规方法。
[0032]实施例1从大肠杆菌中分离和纯化MDM2蛋白
[0033] 称取lg冻存于-80°C冰箱中表达MDM2蛋白的大肠杆菌（E.coli)菌体，加入10ml Bufferl，上下颠倒混匀。超声工作时间为工作3s，间歇5s，循环90+30次，功率为360W。 13000rpm，4 °C离心lh，留上清，弃沉淀。
[0034] 取0 ? 5ml Ni-NTA琼脂糖于2ml透析管中，加入lml Buffer 1 (20mM Tris ? base， 300mM NaCl，15mM imidazole，lmM0-ME，pH 8.0)平衡，静置5分钟后，2000rpm离心30s。平衡 两次。
[0035] 将细胞破碎后的上清分次加入到平衡后的透析管中，将收集管中的液体再倒回透 析管中重复一次，使用混匀仪混匀，使蛋白与Ni-NTA beads充分接触，2000rpm离心30s。
[0036] 再用2ml Buffer2(20mM Tris ? base，50mM NaCl，15mM imidazole，lmM0-ME，pH 8.0) 于透析管中，上下颠倒混匀，静置约2分钟，2000rpm离心30s。倒掉收集管中的液体，再 重复步骤5次，取第五次的滤出液测0D 26q，看非特异性蛋白残留，如果需要，多洗几次，每次 均需2000rpm离心30 s。直至0D26Q接近0 〇
[0037] 加入0 ? 5ml Buffer3(20mM Tris .base，50mM NaCl，150mM imidazole，，pH 8.0) 于透析管中，静置5分钟，2000rpm离心30s，保留滤出液，再加入0.5ml Buf f er3于透析 管中，静置5分钟，2000rpm离心30s，两次滤出液合并，取10ul，电泳检测蛋白质纯度，OD260检 测MDM2蛋白质浓度，浓缩至10mg/ml。
[0038] Ni-NTAbeads的回收。加入lml Buffer4(20mM Tris.base，200mM NaCl，250mM imidazole，ImM EDTA, lmM0-ME，pH 7.5)于透析管中，清洗两次。用20%乙醇液封透析管4°C 保存。
[0039] MDM2蛋白分离纯化结果通过SDS-PAGE电泳进行检测，其结果如图3所示：其中M为 标准蛋白Marker; T为超声破碎后溶液;S为超声破碎离心上清液;P为超声破碎离心沉淀;S1 为纯化Buf f er2洗脱液;S2为纯化蛋白MDM2。
[0040] 由S2蛋白条带可判断MDM2的分子量约为22.4kDa，且条带清晰，说明亲和层析纯化 MDM2效果很好，可直接用于进行后续实验研究。经计算MDM2蛋白的提取率，采用lg菌体，获 得了 20mg电泳纯的蛋白质。
[0041] 从上述实施例可以看出，本发明提供的简易快速的蛋白质分离纯化方法，在提取 带有组氨酸的蛋白以及多肽时，通过镍离子金属鳌合亲和层析介质和不同缓冲液的洗脱， 可以快速去除杂蛋白，富集目标蛋白，提高了蛋白质的分离和纯化效率，大大降低了蛋白质 的损失，操作简便，层析材料可以回收重复使用，节约成本，该方法能够一次性处理lg -500g 带有组氨酸的蛋白或多肽的大肠杆菌，达到电泳纯(>95%)，根据表达的可溶性外源蛋白的 量，纯化的外源蛋白产量可达到l〇mg至10g蛋白，可用于单一蛋白质的生产，而无需购买专 门的蛋白纯化设备，为研究和生产人员节省了设备的购买和维护成本。
【主权项】
1. 一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 在透析管中均匀添加一定量的亲和层析填料，用Buffer 1平衡后，将待分离蛋白溶 液缓慢添加到透析管中，上下颠倒混匀数次，静置使溶液缓慢流下或2000rpm慢速离心； 52、 将步骤S1收集管得到的溶液重新倒回分离管中，上下颠倒混匀数次，静置，如此反 复三到四次； 53、 将步骤S2最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 2洗脱杂蛋白； 54、 将步骤S3最后一次结合的离心液弃掉，在分离管中加入Buffer 3将目的蛋白洗脱 下来； 55、 取步骤S4收集管收集的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳检测； 56、 纯化之后用Buffer 4反复清洗离心管三到四次，用20 %乙醇溶液液封，置于4 °C层 析柜保存备用。2. 根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述亲和 层析填料为镍离子金属鳌合亲和层析介质。3. 根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述 Buffer 1包含以下组分： 20mmol/L Tris.base,300mmol/L NaCl, 15mmol/L imidazole, lmmol/UHVIE，溶液终浓 度为pH 8.0。4. 根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述 Buffer 2包含以下组分： 20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl, 15mmol/L imidazole，lmmol/LP-ME，溶液终浓 度为pH 8.0。5. 根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述 Buffer 3包含以下组分： 20mmol/L Tris.base,50mmol/L NaCl, 150mmol/L imidazole, lmmol/UHVIE，溶液终浓 度为pH 8.0。6. 根据权利要求1所述的一种简易快速的蛋白质分离纯化方法，其特征在于，所述 Buffer 4包含以下组分： 20mmol/L Tris.base,200mmol/L NaCl,250mmol/L imidazole,lmmol/L EDTA,lmmol/ U3-ME，溶液终浓度为pH 7.5。
【文档编号】C12N9/00GK105820209SQ201610265269
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】黄迎春, 齐心洁, 王玥, 李莘
【申请人】北京联合大学