一种EphB4 受体靶向多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及放射性药物标记和核医学技术领域，特别是涉及EphB4受体靶向多 肽、放射性核素标记的EphB4受体靶向多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] Eph是已知受体酪氨酸激酶家族（RTKs)中最大的亚家族。EphAl作为第一个明确 的受体，已经被发现在肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种实体瘤中表达。EphA2在人黑色素 瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌中表达水平也增高，而且增高水平与肿瘤的恶性程度、转移行 为正相关。研究表明，EphB4受体在肿瘤开始的最初阶段就有表达，并且超过60%的实体肿 瘤中都有EphB4受体的异常表达。EPh受体的高表达与实体瘤的生长密切相关。EphB4受 体及ephrinB2配体在多种肿瘤组织中呈扩增和（或）过表达，但它们在肿瘤发生、演进以 及肿瘤血管生成中的作用及调控机制目前尚不清楚。但相关研究表明，在肺癌、骨肉瘤、胃 癌等肿瘤组织中EphB4和EphrinB2表达均高于相应的正常组织。因此，通过明确肿瘤的中 EphB4的表达水平可指导肿瘤治疗、预测放化疗疗效与判断患者预后。
[0003] TNYL-RAW多肽的相关衍生物对EphB4的平衡解离常数（Kd)达到1. 98-23nmol/ L。 研究人员通过化学修饰法，在TNYL-RAW通过偶联双功能螯合剂，获得具有生物学活性 的D0TA-TNYL-RAW，进行放射性核素 64Cu标记，获得首个可用于EphB4受体高表达PET/CT 分子显像的信息分子探针64Cu-D0TA-TNYL-RAW。而后，进行了红外荧光分子探针Cy5. 5分 别进行核素/红外的分子显像。结果表明，核素/红外标记的D0TA-TNYL-RAW能够特异 性被EphB4高表达的CT26细胞及PC-3M细胞所摄取，但在EphB4低表达的A549细胞中， 摄取较低。与此同时，将该TNYL-RAW偶联到远红外纳米粒子NIRF-CCPM上，并进行放射 性核素的 mIn标记，获得可同时用于核医学/光学显像的mIn-标记的TNYL-RAW-CCPM 纳米粒子，研究表明，其对EphB4受体表现出了特异性的显像（Zhang R, Xiong C, Huang M, et al. Peptide-conjugated polymeric micellar nanoparticles for Dual SPECT and optical imaging of EphB4 receptors in prostate cancer xenografts[J] ? Biomateria ls，2011，32(25) : 5872-5879)。该技术所用的TNYL-RAW生物半衰期较短，且EphB4靶向性较 差，且通过CCPM纳米粒子进行间接偶联的核素，无法直接使用。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种EphB4受体靶向多肽及其应用。
[0005] 本发明的第二个目的在于提供放射性核素标记的EphB4受体靶向多肽在EphB4受 体高表达肿瘤诊断及治疗中的应用。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明将具有较强的EphB4受体亲和力的TNYL-RAW类似 物为母体，利用氨基酸内部环化技术，获得c-(TNYL-RAW)多肽，而后利用螯合剂进行偶联， 获得可用于EphB4受体靶向的标记前体N0TA-c-(TNYL-RAW)。
[0007] 本发明首先提供一种EphB4受体靶向多肽，其是以TNYL-RAW为母体，经过环化作 用，再与螯合剂偶联得到；所述TNYL-RAW含有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。所述螯 合剂为双功能螯合剂。
[0008] 优选地，本发明提供的EphB4受体靶向多肽，为NOTA-c- (TNYL-RAW)，其是将 TNYL-RAW上的氨基与羧基先偶联并连接成环，获得c- (TNYL-RAW)，通过c- (TNYL-RAW)上的 氨基与N0TA继续偶联，获得NOTA-c- (TNYL-RAW)。
[0009] 将NOTA-c-(TNYL-RAW)配制为l-10mg/ml，以5mg/ml为最优选，可用于制备放射性 核素标记的分子探针，进而可用于制备EphB4受体高表达肿瘤诊断显像剂或试剂盒中的应 用或在制备EphB4受体高表达肿瘤靶向治疗药物。
[0010] 本发明提供了制备EphB4受体靶向多肽的方法，含有以下步骤：
[0011] (1)将TNYL-RAW上的氨基与羧基先偶联并连接成环，按照TNYL-RAW与偶联试 剂EDC的摩尔比为1 :1-5混合，以水为溶剂，避光反应2-24h，用多肽分离装置分离获得 c-(TNYL-RAW)；
[0012] (2)通过c-(TNYL-RAW)上的氨基与螯合剂继续偶联获得。
[0013] 其中，步骤（2)是按照与c-(TNYL-RAW)的摩尔比1 :1-5加入螯合剂，同时按照与 c- (TNYL-RAW)的摩尔比1 :1-3加入EDC偶联剂，避光反应2-24h，以半制备HPLC分离获得。
[0014] 优选地，本发明所述螯合剂为N0TA。
[0015] 优选地，上述步骤（1)中，TNYL-RAW与偶联试剂EDC的摩尔比为1 :2,避光反应时 间为10h。
[0016] 优选地，上述步骤（2)中，按照与c-(TNYL-RAW)的摩尔比1 :3加入螯合剂，同时按 照与c-(TNYL-RAW)的摩尔比1 :2加入EDC偶联剂，避光反应12h。
[0017] 进一步地，本发明提供了一种放射性核素标记的分子探针，是用放射性核素标记 本发明提供上述EphB4受体靶向多肽得到；所述放射性核素为任何能与螯合剂结构配位的 正电子放射性核素或治疗放射性核素。
[0018] 在本发明的实施例中，放射性核素标记的分子探针是用放射性核素标记 NOTA-c-(TNYL-RAW)得到，具体通过如下方法制备：配置5mg/ml的NOTA-c-(TNYL-RAW) 的水溶液，取出含〇. 005-0. 05mg NOTA-c-(TNYL-RAW)的水溶液，加0. 1M pH5. 5的醋酸钠 (NaAc)溶液中，调节至pH 3. 5-4. 5,获得反应缓冲液，而后向其中加入37_3700MBq的核素， 在25-120°C下反应15-60min即得放射性核素标记的分子探针。
[0019] 优选地，向其中加入370MBq的核素，在100°C下反应0. 25h即得。
[0020] 本发明还提供了一种用于诊断EphB4受体高表达肿瘤的显像剂，其为含有诊断用 放射性核素标记NOTA-c-(TNYL-RAW)的分子探针，所述诊断用放射性核素为任何能与N0TA 结构配位的正电子放射性核素。所述诊断用放射性核素为 686&、64&1、1乍，体积为0.1-1.〇!111。
[0021] 本发明还提供一种用于生物靶向治疗EphB4受体高表达肿瘤的药物，含有治疗用 放射性核素标记NOTA-c-(TNYL-RAW)的分子探针，所述治疗用放射性核素为任何能与N0TA 结构配位的治疗用放射性核素。所述治疗用放射性核素为 mLu，体积为0. 1-1. 0ml。
[0022] 本发明实施例中记载了制备6SGa标记NOTA-c-(TNYL-RAW)的分子探针的方法，具 体为：取含有〇? 005-0. 05mg的多肽标记前体N0TA-c-(TNYL-RAW)的水溶液（l-10mg/ml)， 向其中加入1. 0M醋酸钠调节至pH 3. 5-4. 5,而后向其中加入0. 5-1. OmL (约37-3700MBq) 新鲜的6SGa淋洗液。控温25-120°C反应15-60min。经C-18柱分离纯化，收集获得。
[0023] 采用Sep-pak C18柱分离纯化，在使用之前需先以lOmL乙醇，lOmL纯水活化。而 后将标记体系加入到sep-pak柱中，先以5mL纯水淋洗除去其中 6SGa3+的杂质等。而后以 lmL 80 %的乙醇溶液淋洗，而后向体系中加入4mL生理盐水得6SGa-N0TA-c- (TNYL-RAW)注 射液。
[0024] 本发明提供的本发明提供的6SGa-N0TA- (TNYL-RAW)的PET显像结果表明， 6SGa-N0TA-c-(TNYL-RAW)能够准确定位EphB4受体高表达的肿瘤，并在2-4h间在人脑胶质 瘤U87细胞种植的EphB4高表达的BALB/c鼠中清晰可见。这表明， 6SGa-N0TA-c- (TNYL-RAW) 是一种特异性对EphB4受体高表达肿瘤分子显像剂。
[0025] 本发明实施中记载了制备64Cu标记NOTA-c-(TNYL-RAW)的分子探针的方法，具体 为：取含0? 005-0. 05mg的多肽标记前体NOTA-c-(TNYL-RAW)水溶液（l-10mg/ml)，向其中 加入 0? 1M pH 5. 5NaAc 0? 2-1. OmL，再向其中加入 0? 01-0. lmL(37-3700MBq)新鲜的 64Cu 淋 洗液。控温90°C，以Radio-HPLC监测反应至基本完成（一般15-60min)。经S印-Pak柱分 离纯化，收集产品。获得产品，Radio-HPLC分析放化纯度>98 %。
[0026] 本发明提供一种用于生物靶向治疗EphB4受体高表达肿瘤的药物，含有治疗用放 射性核素标记NOTA-c- (TNYL-RAW)的分子探针，所述治疗用放射性核素为任何能与N0TA结 构配位的治疗用放射性核素。优选地，治疗用放射性核素为 mLu。
[0027] 本发明实施中记载了制备mLu标记NOTA-c- (TNYL-RAW)的分子探针的方法，具 体为：取含 〇? 005-0. 05mg 的多肽前体 NOTA-c-(TNYL-RAW)，向其中加入 0? 1M pH 5. 5NaAc 0? 2-1. OmL，调节至 pH 3. 5-4. 5,再加入 0? 01-0. lmL (约 37-3700MBq)新鲜的 mLu 淋洗液。 控温90°C，以Radio-HPLC监测反应至基本完成（一般20min)。经市面可售的C-18柱分离 纯化，收集产品。获得产品，Radio-HPLC分析放化纯度>98 %。
[0028] 本发明通过化学/生物学修饰，首次将TNYL-RAW进行环化，获得c (TNYL-RAW)，有 效提高了其体内代谢半衰期和对EphB4受体的亲和力和生物相容性，通过与N0TA的偶联， 获得EphB4受体靶向的分子探针标记前体NOTA-c-(TNYL-RAW)。而后分别与诊断核素（如 18F，6SGa，64Cu)进行放射性标记，获得了高亲和力，长体内循环半衰期及易于直接标记的新 型EphB4靶向的分子探针。得到相应的 1SF (6SGa，64Cu) -NOTA-c- (TNYL-RAW)分子探针，借助 于PET/CT设备，用于EphB4高表达肿瘤的早期诊断与精确定位。与治疗用核素（如 mLu) 进行放射性标记，得到相应的mLu-N0TA-c-(TNYL-RAW)分子探针，用于EphB4受体靶向的 生物靶向治疗。总之，通过NOTA-c-(TNYL-RAW)分子探针的设计、合成、放化标记获得的新 型分子放射性分子探针，能够与广泛表达在肿瘤患者体内的EphB4受体特异性结合。结合 各种核素的特性，能达到EphB4受体高表达肿瘤早发现、早诊断、早治疗的目的。
【附图说明】
[0029] 图 1 为 6SGa-N0TA-c-(TNYL-RAW)的 Radio-HPLC 分析图，其中图 1A 中 6SGa 的保留 时间为3. 823min，相应标记产物的保留时间为8. 443min，标记率55%，图1B为分离纯化后 6SGa-N0TA-c (TNYL-RAW)的 Radio-HPLC 分析，其保留时间为 8. 241min，放化纯度 >98%。
[0030] 图2为静脉注射18. 5MBq 6SGa-N0TA-c- (TNYL-RAW)在U87荷瘤鼠动物模型体内的 PET/CT显像情况。图2A为注射后lh，图2B为注射后2h，箭头所指位置为肿瘤。
[0031] 图 3 为 64Cu-N0TA-c- (TNYL-RAW)的 Radio-HPLC 分析图。其中图 3A 中