用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及设及一种分子测定方法，尤其设及用于测定大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法。
【背景技术】
[0002] 大豆疫霉菌侵染大豆引起的大豆根腐病是世界范围内威胁大豆生产的主要病害 之一。大豆根腐病于1948年在美国的印地安那州首次被发现，而后在大豆的主要生产国都 相继发现了该病害。我国1989年由沈崇尧和苏彦纯首次在东北大豆主产区分离到大豆疫霉 菌，之后在黑龙江省、吉林省和北京市也相继发现有大豆疫霉菌，近几年山东、安徽、河南、 江苏、浙江、内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州等15个省(市区）也相继被报道分离 鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，目前仍是我国重要的对外检 疫对象。
[0003] 大豆疫霉菌的进化速度较快，生理小种分化十分复杂，美国目前已鉴定到55个生 理小种和更多未正式定名生理小种的致病型;我国已发现1号、3号、8号、9号、11号、15号、17 号、21号、24号等10个生理小种，其中1号生理小种为黑龙江省的优势小种，同时也鉴定到大 量的未定名生理小种的致病型。
[0004] 目前防治大豆疫霉根腐病最有效的方法是种植抗病品种，而想要准确使用大豆抗 病品种就需要明确待检测大豆疫霉菌(指定地区分离的大豆疫霉菌）的毒性组成（即生理小 种的组成）；而目前生理小种的测定主要采用带有14个抗病基因（Rpsla，Rpslb，Rpslc， I?psld,I?pslk,I?ps2,I?ps3a,I?ps3b,I?ps3c,I?ps4,Rps5,1?ps6,1?ps7 和化s8)的一套近等基因系 鉴别寄主进行下胚轴创伤接种测定，该方法虽然简单易行，但测定周期长、工作强度大、容 易出现中间类型，不适合高通量的生理小种鉴定；因此寻求一种能够快速、准确、高通量测 定大豆疫霉菌毒性组成的方法是本领域亟待解决的技术问题。
[0005] 与本发明相关的公知常识：公知常识（1):病原菌携带有无毒基因或毒性基因，鉴 别寄主携带有抗病基因或感病基因，其中无毒基因与毒性基因是一对等位基因，抗病基因 和感病基因是一对等位基因；当携带有无毒基因的病原菌侵染携带有对应抗病基因的鉴别 寄主时，抗病基因与无毒基因互作使鉴别寄主表现为抗病；当携带有无毒基因的病原菌侵 染携带有感病基因的鉴别寄主时，鉴别寄主表现为感病；当携带有毒性基因的病原菌侵染 鉴别寄主时，不管鉴别寄主是否携带有抗病基因，均表现为感病。公知常识(2):对于无毒基 因与抗病基因的命名，国际上通常是先命名无毒基因，并将能与无毒基因互作使鉴别寄主 表现为抗病的基因命名为对应的抗病基因；即理论上可能会存在多个抗病基因与同一个无 毒基因互作的情况，而实际上也确实如此，例如国际上最初认为大豆疫霉中的无毒基因 Avr4和Avr6分别与大豆中的抗病基因化s4和化s6互作，但进一步的研究发现Avr4和Avr6实 际上是同一个基因，改名为Avr4/6,抗病基因化s4和化s6均能与无毒基因 Avr4/6互作，分别 识别无毒基因 Avr4/6的不同部位来引发抗病反应，由公知常识(2)分析，理论上可能会存在 多个抗病基因与无毒基因 Avr3a互作，即来源于不同抗病材料的抗病基因化s3a可能是完全 不同的抗病基因。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于测定大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83- 570致病性的分子方法，该方法测定周期短、无中间类型、准确可靠，可同时测定多株大豆疫 霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83-570的致病性;为快速、准确、高通量测定大豆疫霉菌毒 性组成奠定了基础。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：用于测定大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，采用CTAB法提取待检测大豆疫霉菌的基因组 DNA;然后设计一对特异性引物并W提取的基因组DNA为模版进行PCR扩增，所述的一对特异 性引物分别结合在无毒基因 Avr3a的上游和下游，从而使PCR扩增出的DNA片段包括完整的 无毒基因 Avr3a;用限制性内切酶BmgBI酶切扩增出的DNA片段，得到酶切产物;对酶切产物 进行琼脂糖凝胶电泳，得到酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳 图，如果在25化p-5(K)bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主 L83-570表现为不致病;如果酶切后在750bp W下有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉 菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为致病。
[000引进一步地，所述的一对特异性引物为AVR3A1F/AVR3A1R，其碱基序列分别为： AVR3A1F:5 -ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3 ; AVR3A1R:日-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3 。
[0009] 进一步地，所述CTAB法提取待检测大豆疫霉菌基因组DNA的具体步骤为： (1) 从培养5-7天的待检测大豆疫霉菌菌落边缘切取10-20块直径2 X 2mm菌丝块，移入 装有100ml澄清的10%V8液体培养基的Ξ角瓶中，置于25°C黑暗条件下、120r/min震荡培养 5-7天，培养好的菌丝体用灭菌双层纱布过滤收集，蒸馈水冲洗1次，经冷冻干燥后充分捣碎 成菌丝粉； (2) 取50mg的菌丝粉于1.5ml EP管中，加入90化1质量浓度为2%的CTAB提取液和90μ1 质量浓度为10 %的SDS水溶液后縱满混合器上充分混匀； (3) 55-60 °C水浴比，每15min振荡混匀一次； (4 )1200化/min离屯、lOmin，取上清液A，加入苯酪、氯仿和异戊醇Ξ者的混合物抽提1 次，所加入的苯酪、氯仿和异戊醇Ξ者的混合物中苯酪、氯仿和异戊醇的重量比为25:24:1， 苯酪、氯仿和异戊醇Ξ者混合物的体积与上清液A的体积相等； (5 )1200化/min离屯、lOmin，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的体积与上清 液B的体积相等； (6) 1200化/min离屯、lOmin，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰无水乙醇过夜 沉淀基因组DNA，所加入NaAc水溶液和冰无水乙醇与上清液C的体积比为0.1:2:1; (7) 用预冷的体积比为70%的乙醇水溶液洗涂两次，然后置于37°C条件下干燥； (8) 干燥后的DNA用100μΙ含50μg/ml核糖核酸酶的d地2〇溶解，37°C静置化后，置于-20 °C冰箱中备用。
[0010] 进一步地，所述PCR扩增的扩增体系和扩增条件分别为： 扩增体系:稀释10倍的PCR反应缓冲液，2.5μ1; 2.5mmol/L的MgCl2，1.扣1; 2.5mmol/L的 dNTPs，0.5μ 1; 5υ/μ 1 的Taq DM聚合酶，0.2μ 1; 1 ΟμL?ο 1 /L的特异性引物AVR3A1F和AVR3A1R各 0.化1;模板DM，0.5μ1;加无菌超纯水至25μ1; 扩增条件:95 °C变性30S，60 °C退火30S，72 °C延伸30S，30个循环，72 °C延伸5min。
[0011] 进一步地，酶切前用AxyPr邱DNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增出的DNA片段，所述 酶切的酶切体系和酶切条件分别为： 酶切体系:稀释10倍的酶切缓冲液，2μ1; 5υ/μ1的Bm浊I酶，0.5μ1;用AxyPr邱DNA凝胶 回收试剂盒回收的DNA片段，6μ1;力时地2〇至20μ1; 酶切条件:37 °C溫育1.化，然后65 °C溫育20min失活。
[0012] 进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳的条件为：1 %琼脂糖凝胶，120V电压下电泳 30min，用0.化g/ml漠化乙锭溶液染色，紫外灯下用Bio-rad凝胶成像系统照相。
[0013] 有益效果：本发明提供了 一种用于测定大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主 L83-570致病性的分子方法，本发明设计的特异性引物AVR3A1F/AVR3A1R能够特异性的与模 版DNA无毒基因 Avr3a的上游和下游相结合，从而使扩增出的DNA片段包含完整的无毒基因 Avr3a，并且在扩增出的DNA片段中无毒基因 Avr3a两端多余的碱基数量较为合理，既节约了 PCR扩增所需的碱基，又能使后续的电泳效果更加明显;本发明通过限制性内切酶BmgBI酶 切待检测大豆疫霉菌的无毒基因 Avr3a来间接测定待检测大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴 别寄主L83-570的致病性，其测定周期短、无中间类型、准确可靠，可同时测定多株大豆疫霉 菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83-570的致病性，为大量、快速和准确鉴定大豆疫霉菌的生 理小种提供有力支持;本发明通过对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳来判断无毒基因 Avr3a 是否被限制性内切酶BmgBI切开，电泳图为2条DNA条带的显然是被酶切成两段的，即对鉴别 寄主L83-570表现为不致病。
【附图说明】
[0014] 图1、实施例所示5株待检测大豆疫霉菌基因组DNA扩增出的DNA片段被限制性内切 酶Bm浊I酶切前后的琼脂糖凝胶电泳图，a图表示酶切前，b图表示酶切后； 图2、实施例所示5株待检测大豆疫霉菌基因组DNA扩增出的DNA片段中无毒基因 Avr3a 的基因序列对比及酶切位点图；点表示碱基与Avr3a(I)行碱基相同，短线表示与Avr3a(I) 行相比发生了碱基缺失； 图3、试验中16株大豆疫霉菌基因组DNA扩增出的DNA片段被限制性内切酶Bm浊I酶切后 的琼脂糖凝胶电泳图； 图1-图3中:A表示不致病，V表示致病；I表示菌株Ps0702，Π 表示菌株Ps0301，虹表示菌 株Ps0705，IV表示菌株Ps0903，V表示菌株Ps0302。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0016] 实施例 5株待检测大豆疫霉菌：菌株Ps0702(2007年分离），菌株Ps0301(2003年分离），菌株 Ps0705(2007年分离），菌株Ps0903(2009年分离），菌株Ps0302(2003年分离），运些菌株均为 采用大豆叶碟诱捕法从中国大豆田±壤中分离，然后经过单抱分离进行纯化，转接于10% V8斜面培养基上12 °C下保存，所述的10 % V8斜面培养基指，在lOOmL用纱布过滤后的V8蔬菜 汁中，加入〇.2g碳酸巧和15g琼脂粉，加蒸馈水补足至lOOOmL，加热使琼脂完全融化，然后分 装在Ξ角瓶中，121°C灭菌20min; 用于测定大豆疫霉菌无毒基因 Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，分别对5 株待检测大豆疫霉菌菌株进行测定，具体测定方法包括W下步骤： 步骤一、采用CTAB法提取大豆疫霉菌的基因组DNA，提取基因组DNA的具体操作如下： (1) 从培养5-7天的待检测大豆疫霉菌菌落边缘切取10-20块直径2 X 2mm菌丝块，移入 装有100ml澄清的10%V8液体培养基（10%V8液体培养基指用蒸馈水稀释10倍的V8蔬菜汁， V8蔬菜汁是美国Campbell公司生产的罐装饮料，由番茄汁、胡萝h汁、芹菜汁、欧芹汁、甜菜 汁、窝宦汁、西洋菜汁和渡菜汁8种蔬菜汁组成）的Ξ角瓶中，置于25°C黑暗条件下、120r/ min震荡培养5-7天，培养好的菌丝体用灭菌双层纱布过滤收集，蒸馈水冲洗1次，经冷冻干 燥后充分捣碎成菌丝粉； (2) 取50mg的菌丝粉于1.5ml EP管中，加入