一种耐高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于β-葡萄糖苷酶耐葡萄糖抑制筛选领域，涉及基于显色化合物平板培养基筛选的耐葡萄糖抑制的高通量筛选方法。
【背景技术】
[0002]β-葡萄糖苷酶是纤维素糖化最关键的限速酶，广泛用于可再生生物质资源的能源应用领域以及食品工业领域。
[0003]纤维素的降解主要涉及到三种纤维素酶，分别是纤维素外切酶、纤维素内切酶和葡萄糖苷酶，纤维素外切酶主要作用于微晶纤维素的还原端或非原端生成纤维二糖，而纤维素内切酶主要作用于不定形纤维素的内部产生纤维二糖和纤维寡糖，葡萄糖苷酶主要作用于纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖。为了实现二代生物燃料的工业化生产，节约生产成本以及提高反应器容积效率是首要任务，因此，增加预处理纤维素浓度是一种很好的解决方案，在高浓度生物质降解过程中，葡萄糖苷酶会受到高浓度葡萄糖抑制而失去活性，造成大量纤维二糖积累，因为竞争性抑制和非竞争性抑制的影响，同时导致纤维素外切酶和纤维素内切酶活性的完全丧失，纤维素停止了酶解反应。很多研究团队已采用定向进化技术改造葡萄糖苷酶，但是主要用于获得高活性、高稳定性的葡萄糖苷酶的筛选，因此，为了解决葡萄糖苷酶受高浓度抑制的问题，采用定向进化技术是一种不错的选择，然而目前尚未发现类似报道，其中很可能最主要原因是没有找到一个合适的高通量筛选方法。
【发明内容】
[0004]基于以上所存在的问题，本发明提供了一种基于平板筛选技术用于获得耐高浓度葡萄糖的葡萄糖苷酶高通量筛选方法，对比其它筛选方法，本发明方法简便实用，特别适用于真菌和细菌葡萄糖苷酶的高通量筛选领域。
[0005]本发明是这样实现的，一种耐高浓度葡萄糖抑制的β_葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于采用显色化合物平板培养基进行高通量筛选，其主要步骤:
[0006]I)将β_葡萄糖苷酶于含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基上进行分泌表达；
[0007]2)挑取阳性克隆子于普通平板培养基上生长；
[0008]3)再将3-10mL的七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度葡萄糖的溶液加入到长有阳性克隆子的普通平板培养基上，于25_70°C下反应l_2h，获得能产生黑色光圈的突变酶。
[0009]所述的“含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基”，其特征在于七叶苷浓度为0.Ι-Ο.2 % 、 枸橼酸铁铵浓度为0.25-2 %。
[0010]所述的“七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度葡萄糖的溶液”，其特征在于七叶苷浓度为0.1-0.2%、枸橼酸铁铵浓度为1-2%和葡萄糖浓度为0-50%。
[0011]本发明的技术效果是:本发明所述的耐高浓度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，可应用于基于定向进化的耐高浓度葡萄糖抑制葡萄糖苷酶的高通量筛选，使耐高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更适合于再生生物质纤维素糖化的能源和食品工业的风味增加等领域。
【具体实施方式】
[0012]通过以下具体实施例，对本发明作详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除本领域的普遍知识和公知常识外，本发明没有特别限制内容。1、将本实验室所保存的草酸青霉16β_葡萄糖苷酶基因与PGAPZaA载体连接，以2000伏电压电转到毕赤酵母GS115中；
[0013]2、将上述重组菌毕赤酵母GS115涂布于含有0.1%七叶苷和0.25%枸橼酸铁铵的YPG(碳源仅有2%甘油)平板培养基中，于30°C培养3-7天，挑取菌落周围有黑色光圈的阳性克隆子；
[0014]3、将阳性克隆子分别接种到4块相同的YPG(碳源仅有2%甘油)平板培养基中，于30 °C分别培养2-5天；
[0015]4、将4mL的0.16 %七叶苷、1.2%枸橼酸铁铵和O %葡萄糖加入到I块阳性克隆子平板上，将4mL的0.16 %七叶苷、1.2 %枸橼酸铁铵和0.5 %葡萄糖加入到第2块阳性克隆子平板上，将4mL的0.16%七叶苷、1.2%枸橼酸铁铵和20%葡萄糖加入到第3块阳性克隆子平板上，于40°C分别培养2-3h，第4块阳性克隆子平板保存。
[0016]5、加了20%葡萄糖的第3块平板完全受到抑制，阳性克隆子周围没有形成黑色光圈，而其它两块平板都有黑色光圈形成。
[0017]6、前期研究表明(论文已发表)，草酸青霉16β_葡萄糖苷酶在0-1%葡萄糖浓度下不会受到抑制，当在>5%葡萄糖时会受到抑制，我们实验完全证实平板高通量筛选耐高浓度葡萄糖的可靠性和方便性。
【主权项】
1.一种耐高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于采用显色化合物平板培养基进行高通量筛选耐糖β-葡萄糖苷酶，其特征是主要步骤: 1)将β-葡萄糖苷酶于含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基上进行分泌表达； 2)挑取阳性克隆子于普通平板培养基上生长； 3)再将3-10mL的七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度葡萄糖的溶液加入到长有阳性克隆子的普通平板培养基上，于25-70°C下反应l_2h，获得能产生黑色光圈的突变酶。2.根据权利要求1所述的一种耐高浓度葡萄糖的β_葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤I中的七叶苷浓度为0.1-0.2%、枸橼酸铁铵浓度为0.25-2%。3.根据权利要求1所述的一种耐高浓度葡萄糖的β_葡萄糖苷酶高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤3的七叶苷浓度为0.1-0.2%、枸橼酸铁铵浓度为1-2%和葡萄糖浓度为0-50%。
【专利摘要】本发明涉及一种耐高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，主要步骤：将β-葡萄糖苷酶于含有七叶苷和枸橼酸铁铵的平板培养基上进行分泌表达，挑取阳性克隆子于普通平板培养基上生长，再将一定体积的七叶苷、枸橼酸铁铵和一定浓度葡萄糖的溶液加入到普通平板培养基上，于一定温度下反应1-2h，获得能产生黑色光圈的突变酶。本发明所述的耐高浓度葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶高通量筛选方法，可应用于基于定向进化的耐高浓度葡萄糖抑制β-葡萄糖苷酶的高通量筛选，使耐高浓度葡萄糖的β-葡萄糖苷酶更适合于再生生物质纤维素糖化的能源和食品工业的风味增加等领域。
【IPC分类】C12Q1/34, C12N9/42
【公开号】CN105624266
【申请号】CN201610095165
【发明人】赵喜华, 易拾, 涂宗财
【申请人】江西师范大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月22日