一种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抑制蛋白相互作用的药物评价的技术领域，更具体涉及一种基于荧光 蛋白i RFP的双分子荧光片段互补系统及应用。
【背景技术】
[0002] 荧光片段互补系统是一种以荧光蛋白为材料的片段互补系统。其基本原理是在 合适的位点将荧光蛋白拆分成氮端和碳端片段，并且这两片段若没有在相互作用蛋白的作 用下，不能自发的互补恢复荧光。若有一对相互作用的蛋白分别与拆分的荧光蛋白的氮端 和碳端片段相融合，在这一对相互作用蛋白的作用下，拆分的荧光蛋白的氮端片段和碳端 片段就会相互靠近，从而恢复完整荧光蛋白的构象而发出特异性荧光。荧光片段互补系统 能够特异性的检测到弱的瞬间相互作用，是一种检测蛋白相互作用的简便、直观、灵敏的方 法。
[0003] 基于荧光片段互补系统的抗病毒药物筛选和评价体系将为药物开发提供简单、 直观、可视、定量化的药物筛选和评价平台技术，在药物研发中提供重要的评价体系，从而 在控制疫情的发展与扩散，保障人民群众的生命财产安全和保障国家安全方面发挥重要作 用。
[0004] 目前，针对特定靶标设计和筛选先导化合物等是国内外药物研发研究的前沿热 点。如利用虚拟筛选方法来筛选靶向HIV-ι的整合酶与人类的LEDGF/P75蛋白相互作用的 抑制剂，从而为治疗HIV-1 提供策略（Hu GP et al.J Mol Model. 2012;18:4995-5003)。但 是，这些方法大多数是基于体外的研究，不能直观的展示其抑制的效果，而筛选到的先导化 合物需要进一步在细胞水平或活体水平上验证其活性。目前的筛选和验证方法还很缺乏。 事实上，病毒在入侵细胞过程或复制过程中需要许多蛋白的相互作用、以及病毒或其重要 致病因子与宿主细胞组分的相互作用，而使其得以入侵和生存。这些蛋白相互作用或侵染 细胞的一些关键步骤是抗病毒药物设计和筛选的主要靶标。基于蛋白分子间相互作用成像 及病毒或其关键致病因子在细胞内的影像分析，将为药物筛选和药效评价提供最直接、真 实、可视化的研究体系，为药物筛选或评价提供重要的技术支撑。当然，基于分子影像的筛 选和评价体系也可以进一步和高通量药物筛选（HTS)或高内涵筛选（HCS)相结合，势必为 药物筛选提供一种简便、可行、实时、可视化的筛选和评价系统。
[0005] 所以，本研究构建了一种用于活细胞内抑制剂药物评价的荧光片段互补系统，用 于在活细胞水平上评价抑制蛋白相互作用的药物。该新系统基于在同一细胞内共表达分别 与iRFP的氮端片段iRN97和碳端片段iRC98相融合表达的蛋白对，用待评价的抑制剂药物 处理细胞。通过测量细胞内iRFP的荧光强度，就可以评价该抑制剂药物对蛋白对相互作用 的抑制功能。该系统为一种简单、有效、方便、可靠的用于活细胞内抑制剂药物评价的荧光 片段互补系统。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在于提供了一种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系 统。该系统包括载体piRN97和piRC98,其中piRN97载体为包含有序列SEQ ID N0. 2的 pcDNA3. 1载体，piRC98载体为包含有序列SEQ ID NO. 3的pcDNA3. 1载体。该系统为一种 简单、有效、方便、可靠的抑制蛋白相互作用的药物的评价系统。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供了一种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补 系统的应用，该系统可以用于蛋白的相互作用，或是用于抑制蛋白相互作用的药物筛选。
[0008] 本发明的设计思路如下：
[0009] 以来源于细菌的光敏色素荧光蛋白iRFP (其序列为SEQ ID NO. 1所示）为材料，选 取合适的拆分位点，在氨基酸97与98位之间将iRFP拆分为两段，分别表达出两个不发荧 光的氮端和碳端蛋白片段iRN97和iRC98,当这两个片段分别与一对相互作用的蛋白相融 合并共表达在同一个细胞内，两个不发荧光蛋白片段iRN97和iRC98就可以被相互作用的 蛋白拉近，重新恢复为蛋白iRFP的完整构象而产生荧光；当药物能够抑制该蛋白-蛋白之 间的相互作用时，iRN97和iRC98则不能被拉近，从而抑制荧光的恢复。成功构建基于iRFP 的双分子荧光互补系统。由于此双分子荧光互补系统具有长波长、37度下成熟的优点，因 此，可以在正常的生理条件下研究蛋白之间的相互作用，该新系统为一种简单、有效、方便、 可靠的抑制蛋白相互作用的药物的评价系统。
[0010] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
[0011] -种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统，该系统包括载体piRN97和 piRC98。
[0012] 所述的piRN97载体为包含有序列SEQ ID NO. 2的pcDNA3. 1载体；piRC98载体为 包含有序列SEQ ID NO. 3的pcDNA3. 1载体。
[0013] 具体的，piRN97载体的制备方法如下：
[0014] 将SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列（本发明或称iRN97基因）利用双酶切位点 EcoRV和XhoI，把iRN97基因插入pcDNA3. 1载体的多克隆位点上，即得载体piRN97 (图1-A)
[0015] 具体的，piRC98载体的制备方法如下：
[0016] 利用双酶切位点Nhel和Hindlll，将SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列（本发明或 称iRC98基因）插入到pcDNA3. 1载体的多克隆位点上，即得piRC98 (图1-B)。
[0017] -种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统的应用，包括用于研究蛋白 的相互作用，或是用于研究抑制蛋白相互作用的药物筛选，具体过程如下：
[0018] 一种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统在研究蛋白的相互作用中的 应用：
[0019] 1)合成的bjun的基因序列（由上海生工合成，参照文献Hu⑶et al.Mol Cell. 2002 ;9:789-98.)，利用双酶切位点Nhel和Hindlll，把bjun基因插入piRN97载体 的多克隆位点上，构建成载体pbJun-iRN97 ;
[0020] 2)合成的bFos的基因序列（由上海生工合成，参照文献Hu⑶et al.Mol Cell. 2002 ;9:789-98.)，利用双酶切位点ΚρηΙ和Notl，把bFos基因插入质粒piRC98的多 克隆位点上，构建成载体piRC98-bFos ;
[0021] 3)质粒pbJun-iRN97和piRC98-bFos共同转染到Hela细胞内，37°C培养24小时 后，分别表达出与bjun和bFos融合表达的蛋白bJun-iRN97和iRC98-bFos，基于bjun和 bFos的相互作用，可以将两个蛋白片段iRN97和iRC98拉近，使其恢复原有的iRFP构象，并 能产生红色荧光。而作为对照，将bFos替换成mbFos的质粒pbJun-iRN97和piRC98-mbFos 虽然能表达出两个蛋白片段iRN97和iRC98,但不会产生荧光。说明基于piRN97和piRC98 的质粒系统可以用于研究蛋白互作。
[0022] -种基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统在抑制蛋白相互作用的药物 筛选中的应用：
[0023] 1)以Hela细胞的RNA为模板，通过随机引物扩增出的cDNA为下一步 模板，通过PCR扩增获得宿主细胞蛋白LEDGF/p75的基因序列，PCR使用的上游 引物：5 ' -CGGCTAGCGCCAC CATGACTCGCGAITTCAAACCTGGAGACC-3 '，下游引物： 5 ' -CCCAAGCTTGTTATCTAGT GTAGAATCCTTCAGAGATAITTCAG-3，，利用双酶切位点 Nhe I 和 Hindlll，把 p75 基因插入 pi RN97 获得质粒 pp75-iRN97 ;
[0024] 2)以质粒 pAD8 (Theodore TS et al. AIDS Res Hum Retroviruses. 1996 FeblO ； 12(3) : 191-4.)为模板，通过PCR扩增获得艾滋病毒整合酶（IN)的基因序列，PCR使用的上 游引物：5' -GGGGTACCGAGCCACCCCCTCCTTITTTGGATGGAATAGAT-3 '，下游引物：5' -AITTGC GGCCGCTTAATCCTCATCCTGTCTACTTGC-3 ^，利用双酶切位点ΚρηΙ和Notl，把整合酶IN基因插 入 piRC98 获得质粒 piRC98-IN.
[0025] 3)质粒pp75-iRN97和piRC98-IN共同转染到293T细胞内，37°C培养24小时后， 分别表达出融合表达的蛋白p75-iRN97和iRC98-IN，基于细胞蛋白p75和整合酶IN的相互 作用，可以将两个蛋白片段iRN97和iRC98拉近，使其恢复原有的iRFP构象，并能产生红色 荧光。
[0026] 4)将分别表达与iRN97和iRC98相融合的蛋白对的质粒转染到哺乳动物细胞，换 液时加入抑制剂药物，经过20-24小时的共孵育，通过测定iRFP的荧光强度，并与对照组相 比较，就可以在活细胞内对抑制剂药物进行可视化评价。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0028] A、含有需共转染的两个质粒piRN97和piRC98,可分别表达出细菌来源的荧光蛋 白iRF P的氮端片段iRN97和碳端片段iRC98 ;
[0029] B、含有氨苄霉素抗性基因，可以用于转化有该共转染质粒的细菌在抗性培养基上 的筛选及培养；
[0030] C、在质粒piRN97和piRC98的相应多克隆位点上分别插入待研究的相互作用蛋白 对，可实现待研究相互作用蛋白对相互作用的研究；
[0031] D、将分别表达与iRN97和iRC98相融合的蛋白对的质粒转染到哺乳动物细胞，换 液时加入抑制剂药物，经过20-24小时的共孵育，通过测定iRFP的荧光强度，并与对照组相 比较，就可以在活细胞内对抑制剂药物进行可视化评价。
[0032] E、该系统用于活细胞内抑制剂药物评价时，只需共转染两个质粒用于表达分别与 iRFP氮端片段iRN97和碳端片段iRC98相融合的蛋白对，另加一个作为内参的EGFP质粒， 即可实现对待研究的抑制剂药物进行筛选。由于此双分子荧光互补系统可以在37度下成 熟，所以可以在细胞正常的生理条件下来研究蛋白间的相互作用。同时，由于基于光敏色素 荧光蛋白i RFP的双分子荧光互补系统具有长波长的优势，可以很好地在动物活体上研究 蛋白间的相互作用，因此，此评价系统可能应用于动物活体上来评价抑制剂药物。由于iRFP 和EGFP的荧光检测无需破坏细胞，可以在荧光显微镜下直接检测，通过测定iRFP的荧光信 号即可简便地评价抑制剂药物对蛋白相互作用的抑制效果。
[0033] F、此系统是基于对iRFP在97-98之间拆分而构建的荧光互补系统，与通常考虑的 在iRF P的PAS和GAF域之间进行拆分有很大的不同，97-98位点并不位于两域之间而是存 在于偏离两域的一个loop环内，所以在最开始选择拆分位点时很容易被忽略，同时，此位 点的拆分而获得的荧光互补效率要显著的高于在两域之间获得的互补效率。
【附图说明】
[0034] 图1-A为载体piRN97的构建示意图。
[0035] 图1-B为载体piRC98的构建示意图。
[0036] 图1-C为不同位点的荧光互补效率的统计图。
[0037] 图2为基于荧光蛋白iRFP的双分子荧光片段互补系统研究p75与IN相互作用的 突光示意图。
[0038] 图3-A为化合物6 (HIV-1 integrase inhibitor 2)验证突光片段互补系统用于 活细胞内抑制剂药物评价可行性的荧光图；
[0039] 图3-B为化合物6 (HIV-1 integrase inhibitor 2)剂量与荧光强度的对应关系 图。
[0040] 图4-A为基于iRFP的荧光片段互补系统在活细胞内评价卡比多巴的荧光图。
[0041] 图4-B为卡比多巴剂量与荧光强度的对应关系图。
【具体实施方式】
[0042] 本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
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