一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化单胺氧化酶，该固定化单胺 氧化酶的制备方法，以及该固定化单胺氧化酶作为催化剂在不对称合成手性氮杂双环化合 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化 剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化 剂的效率高出1〇 7~10 13倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高 纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的 这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质， 其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素（温度、压力、电磁场等）、化学因素（氧 化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH等）和生物因素（酶修饰和酶降解等）均有可 能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速 度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化 工业来说，成本较高。
[0003] 为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质 中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催 化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、 自动化。
[0004] 固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法 又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是 固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或 硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较 大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用得最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便， 但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺载 体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基载 体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研究与应用最为广泛的 一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大（一般残余酶活在30%左右）。
[0005] 博昔普韦（boceprevir)及特拉匹韦（telaprevir)是丙型肝炎病毒（HCV)蛋白酶 抑制剂，其化学结构式如下所示：
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[0007] III期SPRINT-2研究显示，与标准治疗相比，24周的博昔普韦标准治疗可提高HCV 基因1型初治患者的SVR率。博昔普韦标准治疗24周与博昔普韦标准治疗44周的抗病毒 疗效相似。片段A是合成博昔普韦的关键中间体之一，片段A的结构如下：
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[0009] 目前关于片段A主要有如下合成路线：
[0010] 路线1 :TO2007075790公开了利用6, 6-二甲基-3-氧杂双环[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮将内酯内酰胺化、羰基还原、还原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的盐，具 体反应路线如下所示：
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[0012] 由于此路线中的氰基加成利用了硝酸银、氰化钾和盐酸，成本较高，对于后处理和 三废处理也带来了很大困难，不利于工业化生产。
[0013] 路线 2 :文献（Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49， No. 20,6074-6086)中公开了一种以3-苯基四氢吡咯[l，2-c]恶唑-5 (1H)-酮为原料，经过 去氢、环丙烷化、开环、还原、氧化等一系列反应得到关键片段A，具体反应路线如下所示： [00^1
[0015] 由于此路线中的还原反应采用了氢化锂铝和钯碳，反应条件苛刻，后处理较为繁 琐，也不利于工业化生产。
[0016] 路线3 :TO2004113295公开了使用6, 6-二甲基-3-氧杂双环[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮为原料，经过醇解、酰胺化、还原酰胺基和酯基、将氨基保护后氧化醇成醛、成 环、氰基化、水解、去保护得到片段A的盐酸盐，具体反应路线如下：
[001V
[0018] 虽然此路线具有起始原料价廉易得的优点，但该路线在制备（1R，3S)_3-氨甲 基-2, 2-二甲基环丙烷基甲醇时需采取二级还原反应，即，首先利用选自铝烷、在三甲基硅 烷基氯存在下的硼氢化锂或硼氢化钠还原酯基，再使用氢化铝锂或三乙酰氧基硼氢化钠还 原酰胺基，上述还原反应条件剧烈，温度要求苛刻，反应时间较长，后处理繁琐，安全性低， 以致影响了该路线的工业化应用。
[0019] 路线 4 :文献（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6467-6472)公开了 利用来自黑曲 霉（Aspergillus niger)的单胺氧化酶的消除-加成反应制备（lS，2S，5R)-6, 6-二甲 基-3-氮杂-双环[3. 1. 0]己烷-2-腈的方法，如下所示：
[0020]
[0021 ] 该方法通过单胺氧化酶将前手性的胺氧化为手性亚胺，在NaHS03#在的条件下生 成加成产物；后者与NaCN反应得到手性的亚胺加成产物（如上），后者甲醇解得到氨基酸 甲酯盐酸盐。该法立体选择性地构建了 3个手性中心，比化学方法简便、易于操作、对环境 友好；但是亚胺产物易挥发且闪点较低，需要额外加入NaHS03，步骤较为繁琐。
[0022] 片段B是合成特拉匹韦的关键中间体之一，片段B的结构如下：
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[0024] 目前关于片段B的合成路线主要有如下路线：
[0025] 路线1 :EP0600741公开了如下路线：
[00°^1
[0027] 由于由该路线合成得到的目标物存在于油状混合物中，需经过硅胶柱层析分离才 能得到纯品，不仅后处理繁琐，而且无法实现规模化生产。
[0028] 路线2 :TO0218369公开了如下路线：
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[0030] 由于该路线采用DIBAL-H还原，不仅试剂成本较高，而且制备条件苛刻（需 在-78°C下反应），因此此路线也不适合于工业化生产要求。
[0031] 路线3 :CN101463001中公开了如下路线：
[0032:
[0033] 该路线使用了剧毒的羰基钴，不仅成本太高，而且无法满足环保要求，因此该路线 也不能满足产业化要求。
[0034] 路线4 :W02008090819公开了如下路线：
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[0036] 由于该路线的起始原料难以合成、不能批量购得，因此也不适合工业化生产要求。
【发明内容】
[0037] 本发明针对单胺氧化酶在酶催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶 活性损失大或传质困难等问题，将商品化的环氧树脂依次用亚胺基二乙酸（IDA)、硫酸镍进 行衍生化，得到酶固定化载体，而后用单胺氧化酶进行固定化。该固定化方法反应温和，酶 活基本无损失。运用该固定化酶与氧化剂对底物前手性化合物氮杂双环化合物进行氧化反 应，然后与MR发生加成反应制备（1S，2S，5R)-氮杂-双环化合物，可以重复利用5批次，且 分离简单。
[0038] 本发明的内容之一是提供了一种重组单胺氧化酶，其是由SEQ ID No. 2所示的核 苷酸序列编码。
[0039] 制备上述的重组单胺氧化酶的方法，包括：将包括SEQ No. 2所示的单胺氧化 酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，回收双 酶切片段，经T4DNA连接酶连接，形成重组表达质粒pET28a-BYK-MA0N ;将该重组表达 质粒pET28a-BYK-MA0N转化大肠杆菌（E. co 1 i) BL21 (DE3)，即可获得本发明的基因工 程菌株，即 E. coliBL21 (DE3)/pET28a-BYK-MA0N ;将基因工程菌株 E. coliBL21 (DE3)/ pET28a-BYK-MA0N接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培