物种鉴别试剂盒和物种鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种物种鉴别试剂盒和物种鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 细胞培养，最害怕被污染，不仅是要避免细菌，霉菌的污染，也要避免污染到其他 种类的细胞。但是在实验时，常常需要操作不同种类的细胞，即使很熟练的操作人员，还是 有可能会有细胞混杂的情况。
[0003] 由于细胞在显微镜下的型态，差别不大，因此细胞培养时，如果发生细胞污染，是 没有办法可W区别的。W至于一直到实验结束，都不知道使用的细胞，已经不是原本的细胞 了，也导致实验结果不被采信，或是做出错误的结论。
[0004] 因此，如果有一种物种鉴别试剂盒和物种鉴别方法能够简单、快速、灵敏、准确地 鉴别出细胞的物种就显得非常具有意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够简单、快速、灵敏、准确地鉴别物种的 物种鉴别试剂盒，W克服现有技术存在的不足。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
[0007] -种物种鉴别试剂盒，其特征在于:包括一个聚合酶链式反应试剂、一个阳性对照 品、一个无菌水W及至少一种物种的专一性引物对。
[000引在本发明的物种鉴别试剂盒，有15种物种的专一性引物对，所述15种物种的专一 性引物对分别为兔、马、鸡、狗、绿猴、猪、老鼠、大鼠、猫、人、恒河猴、牛、仓鼠、果蛹、鱼的专 一性引物对。
[0009] 在本发明中，通过下列步骤来确定物种的专一性引物对：
[0010] (1)选定待鉴别的物种:依照目前最常见混杂的样品，选定待鉴别的物种。
[0011] (2)比对基因库:捜寻基因库，比对待鉴别物种的异同，选定各物种专一的检测基 因序列作为引物。
[0012] (3)设计引物:选定检测基因序列作为引物，设计聚合酶链式反应所用引物，需考 虑专一性、灵敏度，W及各种反应条件。
[OOK] (4似细胞株模拟物种进行专一性测试：引物设计完成后，W细胞株进行模拟测试 专一性，如专一性不足，则重新设计引物。
[0014] (5) W阳性对照质粒验证灵敏度：引物专一性达标后，W阳性对照质粒来检测引物 灵敏度，目标100颗细胞即可检测，如果灵敏度不足，则重新设计引物。
[0015] (6) W细胞株模拟物种进行专一性测试：引物专一性与灵敏度皆达标后，W细胞株 相互混合，模拟物种混杂，测试引物的鉴别效能。
[0016] 另外，本发明还提供一种物种鉴别方法，该鉴别方法采用上述物种鉴别试剂盒，其 步骤为：
[0017] (I)将待测细胞与各个物种的专一性引物对进行PCR反应；
[0018] (2)将PCR反应产物进行跑胶，获得PCR反应产物大小；
[0019] (3)根据PCR反应产物大小鉴别出待测细胞物种。
[0020] 采用上述技术方案，本发明相比现有技术具有简单、快速、灵敏、准确地鉴别细胞 物种的优点，具体体现在：
[0021] (1)操作简便:只要使用本专利提供的试剂盒，就可W鉴别细胞的物种。
[0022] (2)判读容易:每个物种的聚合酶链式反应产物大小固定，讯号清晰，容易判读。
[0023] (3)专一性强:单一物种只会有专一的讯号，不会与其他物种混淆。
[0024] (4)灵敏度高：100颗细胞就可W正确鉴别物种。
[0025] (5)用途广泛:不仅能够鉴别出单一物种的细胞物种;而且可W鉴别物种混杂的细 胞物种。
【附图说明】
[0026] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明：
[0027] 图1A、图IB为兔的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0028] 图2为马的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0029] 图3A、图3B为鸡的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0030] 图4为狗的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0031] 图5为绿猴的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0032] 图6为猪的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0033] 图7A、图7B为老鼠的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0034] 图8A、图8B为大鼠的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0035] 图9为猫的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0036] 图10A、图IOB为人的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0037] 图11为恒河猴的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0038] 图12为牛的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0039] 图13为仓鼠的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0040] 图14A、图14B为果蛹的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0041 ]图15A、图15B为鱼的专一性引物与15个物种进行PCR反应后的跑胶结果图；
[0042] 图16为兔、马、鸡的专一性引物灵敏度测试结果图；
[0043] 图17为狗、绿猴、猪的专一性引物灵敏度测试结果图；
[0044] 图18为老鼠、大鼠、猫的专一性引物灵敏度测试结果图；
[0045] 图19为人、恒河猴、牛的专一性引物灵敏度测试结果图；
[0046] 图20为仓鼠、果蛹、鱼的专一性引物灵敏度测试结果图；
[0047] 图21为混杂物种鉴别结果图。
【具体实施方式】
[0048] 本发明的物种鉴别试剂盒，包括一个聚合酶链式反应试剂、一个阳性对照品、一个 无菌水W及至少一种物种的专一性引物对。
[0049] 在本实施例中，有15种物种的专一性引物对，该15种物种的专一性引物对分别为 兔、马、鸡、狗、绿猴、猪、老鼠、大鼠、猫、人、恒河猴、牛、仓鼠、果蛹、鱼的专一性引物对，各物 种作为引物的基因序列如表1所示：
[0050] 在实施例中，通过下列方法来获得上述15个物种的专一性引物对：
[0051] (1)选定带鉴别的15个物种:依照目前最常见混杂的样品，选定待鉴别的物种。
[0052] (2)比对基因库:捜寻基因库，比对待鉴别物种的异同，选定各物种专一的检测基 因序列作为引物。
[0053] (3)设计引物:选定检测基因序列作为引物，设计聚合酶链式反应所用引物，需考 虑专一性、灵敏度，W及各种反应条件。
[0054] (4) W细胞株模拟物种进行专一性测试：引物设计完成后，W细胞株进行模拟测试 专一性，如专一性不足，则重新设计引物。
[0055] (5) W阳性对照质粒验证灵敏度：引物专一性达标后，W阳性对照质粒来检测引物 灵敏度，目标100颗细胞即可检测，如果灵敏度不足，则重新设计引物。
[0056] (6) W细胞株模拟物种进行专一性测试：引物专一性与灵敏度皆达标后，W细胞株 相互混合，模拟物种混杂，测试引物的鉴别效能。
[0057] 本发明的物种鉴别方法，该鉴别方法采用上述物种鉴别试剂盒，其步骤为：
[0058] (1)将待测细胞与各个物种的专一性引物对进行PCR反应，反应过程为：
[0059] 步骤 1:变性：94°C，10min;
[0060] 步骤 2:变性:94°C，30sec;
[0061] 步骤 3:退火:60°C，30sec;
[006