鉴别柑橘单胚和多胚的共显性InDel分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及相橘基因组学领域，具体地指一种鉴别相橘单胚和多胚的共显性 InDel分子标记及其应用，该分子标记可W作为相橘单/多胚育种标记辅助选择，为鉴别相 橘单/多胚品种提供新的分子标记。
【背景技术】
[0002] 多胚现象在相橘类植物中很普遍，多胚类型的相橘一粒种子可产生2-10个胚，据 报道一个种子最多出现42个胚。多胚现象是一种特殊的无融合生殖现象，它和有性生殖(单 胚)有明显的区别，不经历减数分裂和受精过程，由体细胞(珠屯、细胞)发育成胚。多胚过程 是无性繁殖方式，后代实际上是母体的无性复制(Clonal copy)。多胚性状在相橘生产中广 泛利用，尤其是在化木育种中通过无融合生殖产生的后代发芽和出苗率高、苗木均匀粗壮、 整齐一致、无病毒和管理方便。如何将多胚特性导入作物一直受育种学家的关注，特别在固 定杂种优势方面具有广阔的应用潜力。如果母本是杂种优系，那么后代将永久保存运种基 因型。我国在水稻杂种优势利用方面处于国际领先，袁隆平院±提出了水稻杂种优势利用 S步曲：系法"到"两系法"再到"一系法"，其中"一系"就指利用无融合生殖来固定杂种 优势。
[0003] 多胚和单胚的鉴定一般是通过肉眼在显微镜下观察，存在着费时、费力、准确率不 高等问题，然而关于相橘多胚性状共分离分子标记的开发，多年来进展缓慢。最重要的原因 是受制于基因组信息的缺乏，分子标记离多胚位点比较远，难W有效利用开发共分离的分 子标记。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的提供了一种鉴别相橘单胚和多胚的共显性InDel分子标记及其应 用，其为相橘胚性的早期诊断及相关分子育种提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供的一种鉴别相橘单胚和多胚的共显性InDel分子标 记，所述共显性InDel分子标记的核巧酸序列分别如SEQ ID NO: 1、沈Q ID N0:2和SEQ ID NO: 3所示。
[0006] 用于获得上述分子标记的引物对，所述引物对分别为：
[0007] 引物对CK F/R [000引正向引物5'
[0009] 反向引物5' ，
[0010] 引物对INS F/R [00川正向引物5'
[0012]反向引物5'
[OOU] 引物对呢L F/R
[0014] 正向引物5'
[0015] 反向引物5'-〇：1'〔641614(：口'44〔641'1'-3'。
[0016] 本发明还提供了一种上述适用于相橘单多胚鉴定的共显性InDel分子标记的制备 方法，包括W下步骤：
[0017] 1)利用前期完成的107个相橘材料均进行深度约为30X的基因组测序，综合已有对 多胚性状的遗传定位结果，选取甜澄4号染色体的2.355-3.83M区域为相橘单多胚相关候选 区域;运用blastn，分别在107份材料中找到该候选区段在各个基因组中的对应同源区段序 列；
[0018] 2)根据材料所属的相橘类别，用BWA软件将107个材料的测序reads分别比对到各 自基因组的候选区段;利用IC0RN2软件，W甜澄基因组候选区域中被注释出来的208个基因 为参考序列，得到各个材料候选区域的208个基因序列；
[0019] 3)利用MEGA软件，逐个查看多序列的比对结果，根据材料的单多胚表型情况，统计 位点的各种碱基/单体型的比率，并人工查看、筛选出与表型关联性程度最高的序列多态 性，发现一个化P的InDel在多胚和单胚材料中差异明显，此结果为基于测序结果预测的单 多胚连锁标记；
[0020] 4)根据W上序列信息，设计了实验验证，将InDel序列TTTATG开发为共显性PCR标 记，分别为检测该InDel的插入并命名为INS-specific，检测InDel的缺失并命名为DEレ specif iC，W及对照命名为CK，综合S者结果，直接从胶图上判断各个材料该位点的基因 型。
[0021 ]作为优选方案:所述步骤4)具体步骤如下：
[0022] 1)设计正向引物3 '端为TTTATG的INS-specif ic引物，如下所示：
[0023] 引物对INS F/R
[0024] 正向引物5 ' -GTATCCTAAAAATATAATCTTTATG-3 '，
[00 巧]反向引物5'-41'〔441'17610：1'1761'〔0：-3'；
[0026] 其PCR产物为SEQ ID NO:2所示，特异检测该化P碱基插入的存在；
[0027] 2)设计正向引物跨越该InDel位点且缺失TTTATG序列的DEkspecific引物，如下 所示：
[002引 引物对DEL F/R
[0029] 正向引物5 ' -CAAAGATTATTGATATGGGAAAG-3 '，
[0030] 反向引物5 ' -CCTCGATGTACCTAACGATT-3 ' ；
[0031] 其PCR产物为SEQ ID NO:3所示，特异检测该位点缺失此化P碱基的情况；
[0032] 3)在该InDel上游处设计正向引物，下游设计反向引物，组成一对CK引物，如下所 示：
[0033] 引物对CK F/R
[0034] 正向引物5 ' -CGTTCTTCAGACCCTTTCAG-3 '，
[0035] 反向引物5'-1610：1'1761'〔0：410：1'1'(：-3'；
[0036] 其PCR产物为SEQ ID NO: 1所示，综合S者结果，直接从胶图上判断各个材料该位 点的基因型。
[0037] 本发明还提供了一种上述分子标记在相橘单多胚鉴定中的应用，利用共显性 InDel分子标记在鉴别115个相橘材料的胚性。
[0038] 本发明还提供了一种上述特异性引物对CK F/R、INS F/R和DELF/R在相橘胚性鉴 定中的应用，利用3个引物对进行PCR鉴定皿抽(单胚）X化irchild相(多胚)杂交群体100株 后代。
[0039] 本发明的意义
[0040] 遗传标记作为生物个体或群体间遗传差异的客观表现，主要是指那些可明确反映 生物多态性的生物特征。随着生物技术的迅猛发展，遗传标记的种类得到了迅速的发展和 丰富，先后出现了形态标记、细胞学标记、蛋白质标记W及DNA标记。DNA分子标记与其他标 记技术相比，具有数量丰富、多态性高、受环境条件和发育阶段影响小、检测手段简单、迅速 等优点。因此，DNA标记作为一种理想的分子标记，已广泛应运与动植物的分子生物学研究， 在基因定位与克隆、物种起源W及驯化方面的研究中发挥着越来越重要的作用。近年来，随 着高通量测序技术的发展，分子标记开发技术也得到了迅猛地发展。利用高通量技术开发 基于PCR技术、操作简单、应用价值大的分子标记，可为控制相橘重要农艺性状的基因定位 和分子标记辅助选择育种奠定基础。
[0041 ] 基于全基因组DNA序列开发的新一代分子标记InDel (Inse;rtion/DeIetion 化Iymo巧M sms)插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本 而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核巧酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失 位点，设计一些扩增运些插入缺失位点的PCR引物，运就是InDel标记，是基因组中一种特殊 类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段DNA序列，属 于共显性标记，具有较好的稳定性和多态性等优点。
[0042] 通过全基因组序列信息挖掘为鉴定单多胚提供了一条快速、有效途径。由于InDel 的二态性，非此即彼，在基因组筛选中往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度。InDel 被认为是继RFLP和SSR之后最有前途的第=代分子标记，在植物领域的遗传图谱构建、性状 相关分子标记开发、W及生物学基础研究正在快速应用。
[0043] PCR扩增目的序列及琼脂糖电泳是鉴别InDel最简捷的方法。根据目的序列设计特 异性引物，W不同个体的基因组DNA为模板，用同一PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增 产物直接进行琼脂糖电泳，仔细核对各个体是否有目的条带就可查明该目的序列在所测各 个体基因组之间是否存在InDel。
[0044] 本发明的有益效果在于：
[0045] 本发明成功得到了相橘胚性的共显性InDel分子标记，运用该标记进行相橘胚性 的鉴别，可W克服传统依靠肉眼鉴别胚性费时、费力、准确率不高的缺点；同时可W在杂交 后代早期（1年W内）进行分子标记诊断，而传统育种等待果实结果产生种子需要3-8年时 间，相比之下，该分子标记应用于辅助育种具有时间早、成本低的优势。该标记可W应用于 育种实践中的不同目标，进行化木育种可利用该标记筛选多胚材料，而进行杂交育种则筛 选单胚材料，从而提高了相橘的育种效率。
【附图说明】
[0046] 图1为引物对CK F/R、INS F/R和DEL F/R设计示意图。
[0047] 图中左侧胶图为结果示例，单/多分别代表表型为单胚/多胚。图2:引物对CK F/R、 引物对INS F/R和引物对DEL F/R分别在相橘自然群体115个品种基因组DNA中的扩增结果。
[004引图中：1代表立花橘（多杂）；3代表道县野橘（多杂）；6代表道县野橘粗皮（多杂）；7 代表崇义野橘(多杂）；9代表红皮酸橘(多杂）；11代表滑皮橘(多杂）；12代表碰相(多杂）；13 代表黄岩本地早（多杂）；14代表溫州蜜相（多杂）；16代表道县-3(多杂）；21代表茶枝相（多 杂）；22代表冰糖橘（多杂）；25代表长沙南橘（多杂）；26代表红橘（多杂）；27代表酸澄（多 杂）；28代表酸澄(多杂）；29代表酸澄(多杂）；30代表酸澄(多杂）；31代表酸澄(多杂）；33代 表暗柳澄(多杂）；34代表锦澄(多杂）；35代表哈姆林(多杂）；36代表桃叶澄(多杂）；37代表 华厮(多杂）；38代表雪相(多杂）；39代表夏澄(多杂）；40代表血澄(多杂）；41代表冰糖澄(多 杂），2代表印度野橘(单胚）；15代表南丰蜜橘(单胚）；32代表班巧甜澄(单胚）；55代表宁波 金相(单胚）；56代表山金相(单胚）；57代表积壳(单胚）；58代表克里曼下(单胚）；59代表沃 相(单胚）；60代表威尔金(单胚）；61代表清见(单胚），62代表临武酸澄(单胚）；63代表紫皮 抽（单胚）；64代表化州橘红(单胚）；65代表沙田抽（单胚）；66代表擅溪蜜抽（单胚）；67代表 无酸抽(单胚）；68代表吉安抽子(单胚）；69代表瑞丽抽子(单胚）；70代表华农红抽(单胚）； 71代表高斑抽（单胚）；72代表桂林抽子(单胚）；73代表晚白抽（单胚）；74代表重庆抽子(单 胚）；75代表浙江抽子(单胚）；76代表马家抽（单胚）；78代表元橘（单胚）；79代表莽山野相 (单胚），80代表小花大翼澄(单胚）；84代表宜昌澄2(单胚）；85代表宜昌澄3(单胚）；88代表 构祿(单胚）；90代表构祿(单胚）；92代表构祿(单胚）；94代表构祿(单胚）；95代表佛手（单 胚）；96代表积壳2(单胚）；97代表积壳3(单胚）；98代表Amo(单胚）；99代表Cpo(单胚）；103代 表Sdi(单胚）；106代表酒饼勒(单胚）；107代表嚷壳刺(单胚）；83代表宜昌澄(单胚）；110代 表Ace