核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及核酸释放剂和干血斑核酸快速提取方法。
【背景技术】
[0002] 干血斑（dried blood spot，DBS)，即将全血样品收集在卡纸上的血液米集方式， 比传统方法有一定的优势，它需求的血量较少，方便血样采集、存储运输，是罕见疾病筛查 过程中的一项有效工具。干血斑早在上世纪六十年代就已被用于苯丙酮尿症的新生儿筛查 中。随着串联质谱技术等的发展，干血斑在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日 渐突显。截至2015年5月，干血斑主要应用于代谢相关疾病的筛查、药物动力学研究以及新 生儿筛查等。对于遗传代谢性疾病而言，代谢酶、代谢产物和核酸能够较为稳定存在于干血 纸片中，因而在对代谢异常类疾病样本进行筛查分析时，干血斑能较为准确地反映样本中 代谢酶、代谢产物及核酸的含量。
[0003] 全血样品的干血斑检测广泛应用于临床疾病检测、流行病学调查、刑事侦缉、亲子 鉴定等多个方面。90年代末和二十一世纪初，随着科学技术的发展，干血斑核酸的提取方法 有了很大的改进，操作更加简单，所需设备少，适合于发展中国家及贫穷边远地区的检测。
[0004] PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的 DNA(核酸)片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点， 是能将微量的DNA大幅增加。而研究表明，血红蛋白中的血红素可通过其卟啉环与Taq酶的 不可逆结合而抑制Taq酶活性，导致检测结果降低，从而影响定量结果的准确性，因此能否 有效避免Taq酶活性降低是影响干血斑核酸的提取纯度的重要因素。
[0005] 目前应用于PCR扩增的核酸提取方法主要有5种：（1)传统煮沸法:裂解液与血液样 本混匀，高温裂解，离心得到核酸；（2)浓缩煮沸法:先用多聚糖浓缩沉淀病毒核酸，再加裂 解液煮沸，离心得到核酸；（3)核酸释放法:核酸释放剂与血液样本混合，高温裂解，得到核 酸；（4)离心柱法:裂解后采用层析柱吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸；（5)磁珠法:用磁珠 吸附核酸，再洗脱得到较纯的核酸。
[0006] 上述前2种提取方法缺点是需要转管、移液、离心等步骤，样本处理耗时长，操作中 难免会丢失部分核酸，使定量值偏低。离心柱法比前2种煮沸法和核酸释放法提取的核酸纯 度大大提高，但手工操作多，效率低。磁珠法提取步骤简单，回收率高，纯度好，易于自动化， 但产品十分昂贵，目前应用并不广泛。目前来说，核酸释放法相比来说操作简单，成本低廉， 对后续荧光定量PCR反应具有较强的抑制作用，因此应用最为广泛，但并没有有效地去除血 红蛋白等杂质，会影响核酸的提取纯度。
[0007] 因此，目前的干血斑的核酸释放法主要存在不能有效地去除血红蛋白等杂质的问 题。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是目前的干血斑的核酸释放法主要存在不能有效地 去除血红蛋白等杂质的问题。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供了一种核酸释放剂，由 Tris-HCl、EDTA、MgCl2、Trixon X-100、KCL和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的 浓度如下：
[0010] Tris-HCl，10~50mM/L;
[0011] EDTA，1~5mM/L;
[0012] MgCl2，10 ~50mM/L;
[0013] Trixon X-100，l~10mM/L;
[0014] KCL，2~20mM/L;
[0015] 蛋白酶K，0.05~0· lmg/mL。
[0016] 在上述核酸释放剂中，1^8-!1(：1的?!1值为7.4。
[0017] 本发明还提供了一种干血斑核酸快速提取方法，包括以下步骤：
[0018] 制备上述的核酸释放剂并于-20°C的环境中储存；
[0019] 制备血斑样品圆片:将干血斑采集卡上的血斑样品制成1个5 X 5mm的样本圆片；
[0020] 提取核酸：将所述样本圆片放入离心管中，再将所述核酸释放剂升温至20°C~25 °C的室温后摇匀加入所述离心管中，浸没所述样本圆片，经过30~45min的56°C温浴处理 后，转移至过滤柱中，通过过滤得到目标核酸。
[0021] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述过滤柱包括上分离管和下收集管，所述 上分离管的上部设置超滤膜组件，所述下收集管通过水平的横管与所述上分离管的底部连 通；
[0022]所述超滤膜组件的材质采用三氧化铝、二氧化钛、氧化锆、醋酸纤维素、磺化聚砜、 聚醚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一种或一种以上的组合，所 述超滤膜组件的结构为卷式、平板式、碟管式、中空纤维式或管式。
[0023]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述超滤膜组件采用的是孔径为20nm的二氧 化钛纳米滤膜。
[0024]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述二氧化钛纳米滤膜的制备方法如下： [0025]以孔径为100nm、孔间距为30~60nm、孔隙率为40%的三氧化铝无机膜作为载体 膜，将所述载体膜经过掺硅二氧化钛溶胶浸渍，然后进行水洗、干燥，在载体膜的孔道内外 形成二氧化钛纳米管，得到孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
[0026]在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述掺硅二氧化钛溶胶的制备步骤如下： [0027] 将异丙酵钛Ti(0i_C3H7)4和正硅酸乙酯Si(0C 2H5)4合为前驱体原料，加入到无水乙 醇中，异丙酵钛Ti(0i_C3H7)4、正硅酸乙酯Si(0C2H5)4和无水乙醇的摩尔数为lmM、lmM、 8.35mM，搅拌并混合均勾形成前驱体溶液；
[0028] 然后另取摩尔数为0.5mM的无水乙醇、0.2mM的硝酸与ImM的水混合呈水解溶液；
[0029] 将水解溶液缓慢滴加到以上的前驱体溶液中，缓慢水解得到浅黄色的透明的掺硅 二氧化钛溶胶。
[0030] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述三氧化铝无机膜在掺硅二氧化钛溶胶浸 渍前，用去离子水清洗并以70°C烘干，自然降至20°C~25°C的室温备用。
[0031]在上述干血斑核酸快速提取方法中，将所述三氧化铝无机膜浸入该溶胶中，5min 后取出干燥，然后升温至400 °C保温4h，最后以100 °C /h降至20 °C~25 °C的室温，备用。
[0032] 在上述干血斑核酸快速提取方法中，所述上分离管从上到下包括内径依次增大的 进口、过滤段、汇聚段和存储座，所述超滤膜组件设置在所述过滤段内，所述下收集管的上 部与所述存储座的侧面连通
[0033] 本发明，采用本发明实施例提供的核酸过滤柱及核酸提取试剂定量检测干血斑的 核酸含量时，其操作便捷，只需将待测样本和所述核酸释放剂在离心管中混匀，采用本发明 提供的核酸释放剂即可实现核酸的释放，并通过过滤柱得到较高纯度的核酸，免去了传统 提取技术中的反复离心、弃上清和转管等操作，在很大程度上简化了实验步骤，减少了核酸 的丢失，使检测灵敏度有了很大的提高，可以对干血斑等血液样本中的核酸快速提取纯化， 重复性好、特异性强、易于判别，且用量少、成本较低、使用安全，适用于不同类型的PCR仪， 可广泛应用于病原微生物的检测、法医学鉴定、基因突变的检测以及组织和血液分型等领 域。
【附图说明】
[0034]图1为本发明和现有对照试剂QIAamp DNA Micro Kit实验结果进行1.5%琼脂糖 凝胶电泳后的对照结果图；
[0035] 图2为本发明的实施例1与现有技术中采用QIAamp Viral RNA Mini Kit的实验结 果的对照图；
[0036] 图3为本发明的实施例1与现有技术中采用QIAamp cador Pathogen Mini Kit的 实验结果的对照图；
[0037] 图4为本发明的过滤柱的结构示意图。
[0038]注:图2和图3中的粗线代表Qiagen试剂的提取结果，细线代表本发明的提取结果。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例对本发明予以详细说明。本文中提到的单位mM是指毫摩尔， mM/L是指毫摩尔每升。
[0040] 本发明提供了一种核酸释放剂，由Tris-HCl(中文名称为:三(羟甲基)氨基甲烷； 氨丁三醇；缓血酸铵;三羟甲基氨基甲烷）、EDTA(乙二胺四乙酸）、MgC12(氯化镁）、Trixon X-100(聚乙二醇辛基苯基醚）、KCL(氯化钾)和蛋白酶K加入无菌水中混合而成，且各组分的 浓度如下：
[0041] Tris-HCl，10~50mM/L;
[0042] EDTA，1~5mM/L;
[0043] MgCl2，10 ~50mM/L;
[0044] Trixon X-100，l~10mM/L;
[0045] KCL，2~20mM/L;
[0046] 蛋白酶K，0.05~0· lmg/mL。
[0047] 优选的，各组分的浓度如下：
[0048] Tris-HCl，10~20mM/L;
[0049] EDTA，l~2.5mM/L;
[0050] MgCl2，10 ~20mM/L;
[0051] Trixon X-100，l~5mM/L;
[0052] KCL，5~15mM/L;
[0053] 蛋白酶K，0.06 ~0.08mg/mL。
[0054] 优选的，1^8-!1(：1的？!1值为7.4。
[0055] 本发明还提供了一种干血斑核酸快速提取方法，包括以下步骤：
[0056] 制备上述核酸释放剂并于-20°C的环境中储存；
[0057]制备血斑样品圆片:将干血斑采集卡上的血斑样品制成1个5 X 5mm的样本圆片； [0058]提取核酸：将样本圆片放入离心管中，再将核酸释放剂升温至20°C~25°C的室温 后摇匀加入离心管中，浸没样本圆片，经过30~45min的56°C温浴处理后，转移至过滤柱中， 通过过滤得到目标核酸。
[0059]优选的，如图4所示，过滤柱包括上分离管和下收集管5,上分离管的上部设置超滤 膜组件21，下收集管5通过水平的横管51与上分离管的底部连通；
[0060] 超滤膜组件的材质采用三氧化铝、二氧化钛、氧化锆、醋酸纤维素、磺化聚砜、聚醚 砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚酰亚胺、聚哌嗪、聚乙烯醇中的一种或一种以上的组合，超滤膜 组件的结构为卷式、平板式、碟管式、中空纤维式或管式。
[0061] 优选的，超滤膜组件采用的是孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
[0062] 优选的，二氧化钛纳米滤膜的制备方法如下：
[0063]以孔径为100nm、孔间距为30~60nm、孔隙率为40%的三氧化铝无机膜作为载体 膜，将载体膜经过掺硅二氧化钛溶胶浸渍，然后进行水洗、干燥，在载体膜的孔道内外形成 二氧化钛纳米管，得到孔径为20nm的二氧化钛纳米滤膜。
[0064]优选的，掺硅二氧化钛溶胶的制备步骤如下：
[0065] 将异丙酵钛Ti(0i_C3H7)4和正硅酸乙酯Si(0C2H 5)4合为前驱体原料，加入到无水乙 醇中，异丙酵钛Ti(0i_C3H7)4、正硅酸乙酯Si(0C2H5)4和无水乙醇的摩尔数为lmM、lmM、 8.35mM，搅拌并混合均勾形成前驱体溶液；
[0066] 然后另取摩尔数为0.5mM无水乙醇、0.2mM硝酸与ImM水混合呈水解溶液；
[0067] 将水解溶液缓慢滴加到以上的前驱体溶液中，缓慢水解得到浅黄色的透明的掺硅 二氧化钛溶胶。
[0068]优选的，三氧化铝无机膜在掺硅二氧化钛溶胶