Srgn基因作为检测三阴性乳腺癌血清标志物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及SRGN基因作为检测三阴性乳腺癌的血清标志物的应用。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是女性中发病率最高、危害最严重的恶性肿瘤之一。近年来，随着治疗手段的更新、治疗方案的改进及治疗方式的多样化，乳腺癌的临床治疗效果得到了很大改善，但是，目前全世界每年仍有约50万人死于乳腺癌。究其原因，乳腺癌是一类分子水平上具有高度异质性的疾病。在临床、病理组织学形态上相同的肿瘤，其分子遗传学改变并不一定相似，这些因素影响了其治疗及预后，因此以分子分型差异为依据，进行个体化、个性化治疗是未来乳腺癌治疗的发展方向。
[0003]肿瘤分子分型最早是在1999年由美国国立癌症研究所提出，通过综合的分子分析技术使肿瘤的分类基础由形态学转向以分子特征为基础的新的肿瘤分类系统。乳腺癌根据其不同的分子特征(ER、PR、HER2、Ki67等状态)，一般可分为Luminal A型(ER、PR阳性，HER2阴性、Ki67低表达)、Luminal B型(ER、PR阳性，HER2阴性或阳性、Ki67高表达或任何水平)、HER2过表达型(ER、PR阴性，HER2阳性)、基底样型；其中基底样型乳腺癌约80%均不表达ER、PR及HER2，也称为“三阴性”乳腺癌(TNBC)。
[0004]不同的分子分型其治疗方案及愈后也不尽相同。Luminal A型多以内分泌治疗为主。基于Luminal B型的上述特殊性，患者在内分泌治疗的基础上，有时须接受化疗和抗HER2靶向治疗。HER2过表达的乳腺癌亚型以靶向治疗和化疗为主。而三阴性乳腺癌(TNBC)因其缺乏内分泌和靶向治疗的靶点，其对内分泌疗法和HER2靶向疗法均无效，临床治疗上主要依靠化疗，预后极差，5年生存率不到15%。流行病学资料显示，TNBC好发于年轻女性(年龄〈50岁)，其发病较为隐匿，通过乳腺钼靶首次检出乳腺癌的几率低。与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC的远处复发至死亡的中位间期明显缩短(平均9个月)，因此迫切需要寻找TNBC特异性的检测标记物和治疗靶点。
[0005]SRGN是一种主要分布在细胞内的小分子量糖蛋白，但也可以分泌和整合到细胞外基质中。其由核心蛋白和附着在其上的多种粘多糖(GAG)组成，根据结合的粘多糖的类型分为:硫酸软骨素类，如CS_4( Chondroitin-4-sulfate)、CS_6、CS-B，和肝素类(heparin/heparin sulfate)。其核心蛋白由位于染色体10q22.1 SRGN基因编码，长158个氨基酸，分三个区域组成:信号肽(1-27位氨基酸残基组成)，N端(28-76位氨基酸残基组成)和C端(77-158位氨基酸残基组成)，C端有多个丝氨酸/甘氨酸重复区，主要与GAG结合，N端有两个半胱氨酸残基。SRGN主要表达在血液系统各种细胞、一些肿瘤细胞、内皮细胞、胚胎干细胞上。最近研究发现SRGN可体外诱导鼻咽癌细胞发生EMT的改变，促进鼻咽癌细胞转移。另外发现SRGN在肝癌中表达升高，可作为一个预后监测指标。
[0006]然而，关于SRGN作为乳腺癌血清学检测标志物尚未见有相关的研究和报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服现有乳腺癌分型检测和治疗技术的缺陷和不足，提供SRGN基因作为检测三阴性乳腺癌的血清标志物的新应用，为乳腺癌的检测尤其是“三阴性”乳腺癌检测提供新的靶点，并且为抗肿瘤药物的设计和筛选提供了新的资料。
[0008]本发明的目的是提供SRGN基因及其多肽在作为乳腺癌分子分型的检测标志物或在制备乳腺癌分子分型的检测试剂方面的应用。
[0009]本发明另一目的是提供SRGN基因及其多肽在作为检测三阴性乳腺癌的血清标志物或在制备三阴性乳腺癌的检测试剂方面的应用。
[0010]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
具体地，首先，我们利用RT-PCR方法在不同分子分型乳腺癌细胞系中检测SRGN表达，发现SRGN在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-23UBT549中表达含量明显高于Luminal A型MCF7、T47D细胞系，和Luminal B型BT474细胞系，以及HER2过表达型SKBR3、MDA_MB_453细胞系。
[0011]此外，我们利用酶联免疫实验检测以上不同分子分型乳腺癌细胞系培养上清中的SRGN蛋白含量，发现SRGN在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT549的培养上清中的含量明显高于其他分子分型乳腺癌细胞系。
[0012]进一步，我们通过免疫组织化学对不同分子分型的临床乳腺癌标本检测SRGN表达，发现SRGN在病理确定为三阴性乳腺癌的标本中表达量高于其他分子分型乳腺癌。
[0013]另外，我们通过利用酶联免疫实验对乳腺癌患者血清进行检测，发现SRGN在三阴性乳腺癌的血清标本中表达量同时也高于其他分子分型乳腺癌患者。
[0014]因此，本发明提供了SRGN基因作为检测三阴性乳腺癌的血清标志物的应用。具体包括以下多个方面:
SRGN基因在作为乳腺癌分子分型的检测标志物方面的应用。
[0015]SRGN基因在制备乳腺癌分子分型的检测试剂方面的应用。
[0016]SRGN多肽在作为乳腺癌分子分型的检测标志物方面的应用。更优选地，是SRGN多肽在作为乳腺癌分子分型的血清学检测标志物方面的应用。
[0017]SRGN多肽在制备乳腺癌分子分型的检测试剂方面的应用。
[0018]SRGN基因在作为检测三阴性乳腺癌的标志物方面的应用。
[0019]SRGN基因在制备三阴性乳腺癌的检测试剂方面的应用。
[0020]SRGN多肽在作为检测三阴性乳腺癌的标志物方面的应用。更优选地，是SRGN多肽在作为检测三阴性乳腺癌的血清学标志物方面的应用。
[0021 ] SRGN多肽在制备三阴性乳腺癌的检测试剂方面的应用。
[0022]上述SRGN基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0023]上述SRGN多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0024]另外，上述三阴性乳腺癌为ER、PIISHER2，所述的ER、PR及HER2均为阴性。即所述三阴性乳腺癌为ER、PR及HER2均不表达的“三阴性”乳腺癌(TNBC)。
[0025]另外一方面，上述的标志物或检测试剂可以是细胞水平、血清水平或组织标本水平的标志物或检测试剂，也可以是基因水平或蛋白水平的标志物或检测试剂。
[0026]本发明提供了一种新的乳腺癌血清标志物，S卩SRGN基因及其多肽。本发明首次证实了基因SRGN在乳腺癌血清中表达升高，其中主要在三阴性乳腺癌患者血清中较其他分子分型的乳腺癌患者血清明显升高。本发明不仅为乳腺癌血清学检测提供了新的靶点，而且为乳腺癌分子分型提供了新的资料和一个血清学快速检测方法。
[0027]本发明具有以下有益效果:
SRGN基因不仅在三阴性乳腺癌细胞系中表达升高，也在三阴性乳腺癌组织标本和血清中表达较其他分子分型乳腺癌升高。该基因定位于人染色体10q22.1，序列全才1270bp，开放读码框477bp，编码158个氨基酸。本发明的SRGN基因不仅可作为目前临床乳腺癌分子分型中三阴性乳腺癌分型的新检测靶点，而且可通过对乳腺癌患者血清中SRGN进行检测，快速的进行乳腺癌分子分型，优于目前乳腺癌分子分型基于癌组织标本的免疫组织化学检测方法。以这一基因为靶点，在基因水平上和蛋白水平上设计新的化学实体，可快速、便捷、有效的进行乳腺癌的分子分型，从而提高乳腺癌治疗的疗效。
【附图说明】
[0028]图1为SRGN转录本在不同分子分型的乳腺癌细胞系中的表达情况。
[0029]图2为SRGN蛋白在不同分子分型的乳腺癌细胞系中的表达情况。
[0030]图3为SRGN蛋白在不同分子分型的乳腺癌细胞系培养上清中的表达情况。
[0031]图4为SRGN在不同分子分型的乳腺癌标本中的表达情况。
[0032]图5为SRGN在不同分子分型的乳腺癌患者血清中的表达情况。
【具体实施方式】
[0033]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0034]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0035]以下实施例所用细胞:人乳腺癌细胞系MCF7、T47D(Luminal A型)，BT474(LuminalB型)，5防1?3、]\0^-]\?-453(冊1?2过表达型)，]\0^-]\?-231、8了549(了剛0，均为广州医科大学肿瘤研究所保存。细胞均用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养，置于37°C，5% CO2培养箱培养。
[0036]实施例1实时定量PCR分析SRGN在乳腺癌各细胞系中的表达 1、制备cDNA
取生长至对数期的各种培养细胞，TRIZOL方法提取总RNAANaseI消化后，测量RNA。
[0037]以oligdT为引物取等量的 RNA按照Fermentas 公司 Re verse Transcript1nSystem程序逆转录成cDNA。
[0038]2、PCR 检测
以cDNA为模板，按照SYBGreen操作说明，用以下引物进行实时定量PCR扩增:
(I)SRGN基因编码区引物(扩增片段为10bp):
前向引物SRGN-F(SEQ ID勵.3所示):
5’- GCTACTCAAATGCAGTCGGC-3’ ；
后向引物SRGN-R(SEQ ID勵.4所示):
5’- CCATTGGTACCTGGCTCTCC-3’ 。 (2)GAPDH基因编码区引物扩增片段为156bp:
前向引物GAPDH-F(SEQ ID勵.5所示):
5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3’ ；
后向引物GAPDH-R(SEQ ID勵.6所示):
5’-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3’ 。
[0039](3)PCR反应参数:95°C 5min；95°C 30sec,59°C 30sec,72°C 30min共40个循环。70 °C至95 °C绘制溶解曲线。以上实验重复三次。以GATOH为内对照，通过2—Λ算各组之间目标基因SRGN表达水平的差异;按照下列公式计算样本的相对表达量:其中△ ACt =ACt 处理组一ACt对照组；ACt = Ct SRGN-Ct GAPDH。
[0040]3、结论:
如附图1所示，在三阴性乳腺癌细胞系