一种新的强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测强直性脊柱炎易感性的方法和试剂盒，特别是涉及一种利用 基因型检测强直性脊柱炎易感性的新方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 强直性脊柱炎又名别赫捷列夫氏（VonBechterev)病或马-施二氏 (Maritstrumpell)病，是一种慢性、进行性，中轴关节受累的慢性炎症性疾病。主要影响 骨盆的骶髂关节、脊柱关节和椎旁组织。主要症状为下腰痛、脊椎僵硬及运动范围受限、 X线显示两侧骶髂关节炎（sacroilitis)为其特征。由于该病一般先侵犯骶髂关节，并重 点累及脊柱，最终导致脊柱骨性强直，故目前国内外多称之为强直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis, AS)〇
[0003] 强直性脊柱炎有明显的种族性，在不同民族中发病率的差异很大。印第安人发病 率最高，北美印第安人发病率为2. 7%~6. 3%。其次为白种人，白种人中发病率为0. 1%~ 1.4%。黄种人低于白种人，我国约为0.3%。而黑人发病率最低，约为白人的1/4,在非洲 仅为0. 2%。
[0004] 强直性脊柱炎好发于20至40岁的成年人，尤其是20~30岁的青年男性。
[0005] 强直性脊柱炎呈常染色体显性遗传，有明显的家族遗传倾向，遗传因素>90%。 据调查，强直性脊柱炎病人亲属发病率比一般人高一倍左右，同胞复发风险比为82. 90%以 上的AS病人具有HLA-B27阳性，在正常人群中阳性率为8%;子女HLA-B27阳性占50%，发 生强直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定论，HLA-B27作为独立的致病基因在AS的发 病中起作用。因为在HLA-B27阳性个体中只有1 %~5%发展成为AS，提示还有其他基因参 与AS的发病。
[0006] MIR146A基因编码的产物属于一种microRNA，可以在信使RNA水平调节其下游目 的基因的表达和翻译。已有的大量研究证明，MIR146A参与了人体炎症通路的调控，是多个 前炎症反应的调控关键基因。MIR146A基因的多态性位点也被发现与多种自身免疫性疾病， 包括银屑病，系统性红斑狼疮，硬化症等相关。本发明所述的rs57095329位点与强直性脊 柱炎发病的相关性尚未有人提及。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的强直性脊柱炎易感性检测方法和试剂 盒，为辅助诊断（尤其是早期诊断）强直性脊柱炎和治疗强直性脊柱炎提供基础。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种对个体的利用基因型检测强直性脊柱炎易感性 的方法，包括步骤：
[0009] 检测该个体的MIR146A基因和/或转录本，并与正常的MIR146A基因和/或转录 本相比较，存在差异就表明该个体患强直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0010] 在另一优选例中，所述的方法中检测的是MIR146A的基因或转录本，并与正常 MIR146A核苷酸序列比较差异。
[0011] 在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性（SNP):
[0012] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0. 1。
[0013] 在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在MIR146A基因的单核苷酸多 态性的方法，包括步骤：
[0014] 1)用MIR146A基因特异性引物扩增样品的MIR146A基因，得到扩增产物；
[0015] 2)检测扩增产物中是否存在以下的单核苷酸多态性：
[0016] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0. 1。
[0017] 在另一优选例中，所述MIR146A基因特异性引物具有SEQ ID NO. 2和3的序列。
[0018] 在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100_2000bp，且含有SEQ ID NO. 1中第 659 位。
[0019] 在本发明的第三方面，提供了一种利用基因型检测强直性脊柱炎（强直性脊柱炎 易感性）的试剂盒，其包括：特异性扩增MIR146A基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物 扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第659位的扩增产物。
[0020] 在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：
[0021] 1)与SEQ ID NO. 1中第659位的突变结合的探针；
[0022] 2)识别SEQ ID NO. 1中第659位的突变限制性内切酶。
[0023] 在另一优选例中，所述的突变选自以下的单核苷酸多态性：
[0024] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0. 1。
[0025] 所述引物的序列，可如SEQ ID NO. 2和3所示。
[0026] 所述扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID Ν(λ 1中第659位。
[0027] 所述试剂盒还包括：Taq酶、dNTPs、镁离子、常规的PCR反应缓冲液。
[0028] 本发明经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。发 现和证明了 MIR146A的基因组序列与强直性脊柱炎密切相关，其中关联研究结果显示，在 MIR146A 基因的 SEQ ID NO. 1 中第 659 位的 SNP (第 659 位 A - G)(记为 rs57095329)在对 照组和病例组中的分布存在显著性差异（P < 0. 05)，因此，可作为辅助性检测强直性脊柱 炎（或其易感性）的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
[0029] 具体而言，本发明揭示了 MIR146A基因一种单核苷酸多态性（SNP)以及该多态性 与强直性脊柱炎的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO. 1所示序列的第659位的G/A多态， 基因型GG在强直性脊柱炎病人群中的频率，要低于在正常对照人群中的频率。
[0030] 最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用MIR146A基因特异性引物扩增样品的 MIR146A基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：第659 位A -G，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID N0. 1。
[0031] 应理解，在本发明揭示了 MIR146A基因的SNP与强直性脊柱炎的相关性之后，本领 域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等 方法确定是否存在第659位A -G。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽 然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定 的不互补（尤其是引物的5'端）的情况下，也能够特异性地扩增（即仅扩增出所需的片 段）。
[0032] 含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物 扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID N0. 2和3 的序列。
[0033] 虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100_2000bp，较 佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO. 1中第659 位。
[0034] 由于本发明的SNP与强直性脊柱炎具有非常高的关联性，因而可用于早期辅助性 诊断强直性脊柱炎，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措 施，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此，具有极其重大的应用价值和社会效益。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0036] 实施例1
[0037] 一、研究对象
[0038] 病例样本全部采集自门诊病人，患者的诊断由仁济医院富有临床经验的风湿病科 医师根据1984年提出修订的纽约标准作出，并通过多次随访确诊。对照样本选自南方中心 样本库中病例组年龄、性别匹配、无关节炎病史的个体。
[0039] 在知情同意的基础上，随机收集了 96例AS病人和95例健康的正常对照个体的外 周血样本。
[0040] 二、实验方法和结果
[0041] 1、DNA 提取
[0042] 用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA(也可采用商业化的试剂盒，提取 DNA)，浓度校正至20ng/ μ 1后，用于常规PCR扩增。
[0043] 2、用于PCR和测序中的引物设计
[0044] 根据GenBank中MIR146A的基因组序列，设计和合成以下引物：
[0045] 有义引物 PI :5 ' -accgcagaaccaaattaacg-3 ' （SEQ ID N0. 2 所不）
[0046] 反义引物 P2 :5' -aatgaatcctcccaccatca-3 ' （SEQ ID Ν0· 3 所不）。
[0047] 3、MIR146A 基因的 PCR 扩增
[0048] 以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR仪上以Touchdown程序进行 PCR扩增。反应条件为：94°C预变性2分钟，94°C变性30秒，63°C退火40秒，72°C延伸40 秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0. 5°C;以后94°C变性30秒，58°C退火40秒，72°C 延伸40秒，共30个循环；最后72°C延伸7分钟。
[0049] PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得MIR146A基因的扩增产物。
[0050] 4、SNP的发现和检测
[0051] PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-3730DNA测序仪（美国应用生物系统公司 appl