一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及膜蛋白酶抑制剂的提取，具体是一种从亚麻蛋白粉中提取膜蛋白酶抑 制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 亚麻(Linum usitatissimum L.)是一种亚麻科亚麻属的一年生草本植物，其种子 亚麻籽中含有多种生物活性的物质，包括亚麻酸、木酚素以及亚麻胶等。其中蛋白质含量可 达到23%-33%，主要为球蛋白和白蛋白，是植物中优质蛋白。因其丰富的油脂含量，亚麻在 我国的应用主要用于榨油，榨油后的亚麻籽柏中主要成分是蛋白类及亚麻籽胶、植酸等。但 是这一资源并没有得到充分利用，造成了极大的浪费，因此开展对亚麻籽柏的综合利用，对 资源回收利用将产生重要意义。
[0003] 胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的 小分子多肽，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，具有抗病毒、抗肿瘤、抗真菌等活性。广泛存在 于植物、动物和微生物中。胰蛋白酶类抑制剂最初是由Bowan-Birk从大豆中提取而来。陆续 从马铃薯、豇豆、绿豆、苦荞等作物中提取得到了不同种类的胰蛋白酶抑制剂。但是，从亚麻 蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂的方法还未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种从亚麻蛋白粉中分离胰蛋白酶抑制剂的方法，该方法应 简便易操作，对设备要求低，且提取到的胰蛋白酶抑制剂纯度高，活性大且稳定性很好，对 高温和酸性环境具有很强的耐受性。
[0005] 本发明提供的一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂的方法，包括如下步骤：
[0006] 将脱脂后的亚麻蛋白粉，溶于4-6倍体积的pH为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，4 °〇抽提蛋白8-12h，抽提液于高速冷冻离心机13000r/min离心30min后，取上清上样于经pH 为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液平衡的阴离子交换柱Q-Sephar〇Se4B柱，收集穿透样品，浓 缩、干燥后即获得高纯度的亚麻胰蛋白酶抑制剂。
[0007] 本发明从脱脂亚麻蛋白粉中分离得到的胰蛋白酶抑制剂，分子量约为8kDa。
[0008] 与现有技术相比本发明的有益效果：
[0009] 胰蛋白酶抑制剂一般纯化过程大都通过盐析、加热、再结合柱层析的方法分离，步 骤较复杂。而本发明直接Q-Sepharose4B-步从脱脂蛋白粉中获得亚麻胰蛋白酶抑制剂，方 法简单，产物纯度高。对亚麻脱脂蛋白粉利用价值的提升(去除营养限制因子胰蛋白酶抑制 剂），以及胰蛋白酶抑制剂进一步单独开发利用，提供了途径。
【附图说明】
[0010] 图1为蛋白的SDS-PAGE图，其中：泳道1、亚麻蛋白粗提液，泳道2、Q-Sepharose4B柱 穿透的蛋白样品，即亚麻膜蛋白酶抑制剂。
【具体实施方式】
[0011] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0012] 胰蛋白酶抑制剂的分离提取:取脱脂后的亚麻蛋白粉3g加入5倍体积50mM Tris-HC1缓冲液(pH为8.0)4°C抽提蛋白8h。抽提液于高速冷冻离心机13000r/min离心30min后， 取上清上样于用相同缓冲液平衡阴离子交换柱Q-Sepha r〇Se4B柱(购自GE公司），吸附杂蛋 白后，收集穿透样品即获得电泳纯的胰蛋白酶抑制剂，进行SDS-PAGE分析(见图1)
[0013]胰蛋白酶活力的测定:依据胰蛋白酶能特异性酶解底物MPNA，生成显色物质pNA， 在410nm处有最大吸收峰，而胰蛋白酶抑制剂的加入可阻止胰蛋白酶对ΒΑΡΝΑ的酶解，从而 抑制反应后的吸光度值的增加。取一定量的胰蛋白酶抑制剂样品与〇.4mL 0.2mg/mL的胰酶 (购自索莱宝公司）在37°C下保温lOmin后，加入2mL 0.5mg/mL底物ΒΑΡΝΑ(购自Sigma公司）， 再于37 °C下保温lOmin后，加入0.5mL醋酸溶液(w/v为33 % )终止反应，在0D41Q下测量吸光度 值。以不加抑制剂样品为空白对照。37 °C下，每分钟水解ΒΑΡΝΑ生成ΙμΜ对硝基苯胺PNA所需 要的酶量为一个活力单位。在相同条件下，降低一个酶活性单位所需的抑制剂量，为一个抑 制剂活性单位。亚麻胰蛋白酶抑制剂提取过程中的活力测定见表1。
[0014] 表1亚麻胰蛋白酶抑制剂提取过程中的活力测定
[0015]
【主权项】
1. 一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于包括如下步骤： 将脱脂后的亚麻蛋白粉，溶于4-6倍体积的pH为8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中，4°C抽 提蛋白8-12h，抽提液于高速冷冻离心机13000r/min离心30min后，取上清上样于经pH为8.0 的50mM Tris-HCl缓冲液平衡的阴离子交换柱Q-Sephar〇Se4B柱，吸附杂蛋白后，收集穿透 样品，浓缩、干燥后即获得高纯度的亚麻胰蛋白酶抑制剂。
【专利摘要】本发明提供了一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂的方法，属于蛋白质制备领域。是将脱脂后的亚麻蛋白粉，利用缓冲液过夜抽提，经阴离子交换柱Q-Sepharose4B柱吸附杂蛋白后，在穿透样品中得到高纯度的胰蛋白酶抑制剂。本发明成本低、操作简单、对设备要求低，且所得到的亚麻胰蛋白酶抑制剂纯度高、活性强。本发明对亚麻脱脂蛋白粉利用价值的提升(去除营养限制因子胰蛋白酶抑制剂)，以及胰蛋白酶抑制剂进一步单独开发利用，提供了新途径。
【IPC分类】C07K1/18, C07K14/81
【公开号】CN105566491
【申请号】CN201610131496
【发明人】石亚伟, 陈颖璐
【申请人】山西大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月8日