一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于厚垣抱子样细胞的生产技术领域，具体设及一种利用黄抱原毛平革菌 固体发酵玉米賴杆生产厚垣抱子样细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chiysosporium)为一种典型的白腐真菌，属于 非權菌目，伏革科，显革菌属（李慧蓉.白腐真菌生物学和生物技术.化学工业出版社. 2005)。其菌丝一般无隔膜，无锁状联合。分生抱子为异核体，担抱子是同核体。在固体培养 时，该真菌能产生厚垣抱子(chlamydospore)，厚垣抱子个体较大，细胞直径为60μπι左右。此 外，P.chrysosporium还能?一种厚垣抱子样细胞（chlamydospore-likΘcell，QX)的形 式存在（Eunyong C， Junse 0， Sangpill Η， Ik-Sung A, Yeo JY. Enhanced production of manganese peroxidase from immobilized Phanerochaete chrysosporium due to the increased autolysis of chlamydospore-like cells. Biotechnology Letter. 2005， 27 (7): 477-481; Zacchi L， Morris I， Harvey PJ. Disordered ultrastructure in lignin-peroxidase secreting hyphae of the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Microbiology. 2000，146 (3): 759-765)，CLC的细胞 直径为9-15ym，在细胞体积上区别于黄抱原毛平革菌的厚垣抱子，但其也具备厚垣抱子的 易分散、细胞壁厚和易保藏等优点。由于缺少简单、高效的生产手段，CLC的制备十分困难， 因此，国内外研究人员均没有把P. chrysosporium的化C当作一个可深入研究的对象。根据 目前的文献检索，国内外尚没有P. chrysosporium厚垣抱子样细胞生产技术的相关报道。 [0003] P. chrysosporium广泛应用于环境治理如废水处理、上壤及河流污染修复、酶制 剂发酵、农业等领域。对于P. chrysosporium的研究最初集中在生物质资源化方面，由于其 能产生木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP)及输依赖性过氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)，并具有降解包括木质素在内的许多酷型或非酷型化合物的能力(Bumpus JA, Tien Μ, Wright D, Aust SD. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus. Science.1985, 228 (4076): 1434-1436)，因此可 用于木质素的降解及资源化。随后，大量报道表明P. chrysosporium在废水处理(如焦化废 水、染料废水等）、上壤及水体污染生物修复领域也有着广阔的应用前景（Bogan BW， Schoenike B, Lamar 民Τ， Cullen D. Manganese peroxidase m民NA and enzyme activity levels during bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbon- contaminated soil with Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology. 1996， 62 (7): 2381-2386;Rodarte-Morales AI, Feijoo G, Moreira MT, Lema JM. Biotransformation of three pharmaceutical active compounds by the fungus Ph过neroch过ete chrysosporium in 过 fed batch stirred reactor under air and oxygen supply. Biodegradation. 2011， 23 (1): 145-156;Lu Y, Yan LH, Wang Υ, Zhou SF, Fu JJ, Zhang JF. Biodegradation of phenolic compounds from coking wastewater by immobilized white rot fungus Phanerochaete chrysosporium. Journal of Hazardous Material. 2009, 165 (1-3): 1091-1097)。此 夕hP. chrysosporium作为生物农药还可W防治病虫害，并能通过降解作物连作后±壤里 的大量化感物质（如酪酸类物质），解除连作作物的自毒作用。徐淑霞等发现P. chrysosporium对黄瓜连作±壤中的径基苯甲酸、香草酸、阿魏酸等酪酸类物质具有明显的 降解作用，±壤经P. chrysosporium修复后，黄瓜根部病害明显减轻，枯萎病及根结线虫病 相对病情指数降低(徐淑霞，张世敏，尤晓颜，贾新成，吴坤.黄抱原毛平革菌对黄瓜连作上 壤酪酸物质的降解.应用生态学报.2008，19 (11): 2480-2484)。因此，P. chrysospori皿 可作为防治剂用于作物病虫害防治及连作障碍的消除。
[0004] 作物賴杆如玉米賴杆是农作物生产过程中产生的一种重要生物质资源。现阶段我 国对賴杆处理的方法主要是W还田为主，约37%的賴杆直接W肥料的形式利用，但賴杆肥料 在使用前需要经过一定的预处理工艺，变相增加了成本。其次22.6 %的賴杆被用作牲畜饲 料处理，但直接饲喂賴杆消化率极低，其中的营养物和有效能量并不能直接被家畜吸收利 用。剩余的农作物賴杆被直接焚烧或弃置，造成资源的极大浪费，并对大气环境造成严重污 染。因此，如何有效利用大量的賴杆资源已成为人们研究的焦点。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是提供了一种利用黄抱原毛平革菌固体发酵玉米賴杆生 产厚垣抱子样细胞的方法，该方法W玉米賴杆作为营养基质，利用黄抱原毛平革菌固体发 酵生产厚垣抱子样细胞，产生的厚垣抱子样细胞在环境治理、酶制剂发酵和农田生物修复 等领域具有一定的应用潜力。
[0006] 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用黄抱原毛平革菌固体发 酵玉米賴杆生产厚垣抱子样细胞的方法，其特征在于:黄抱原毛平革菌利用玉米賴杆为碳 源，通过固体发酵产生厚垣抱子样细胞，其中每千克固体发酵培养基含W下成分:玉米賴杆 粉碎物300-500g、酒石酸锭50g、KH2P〇4 26g、MgS〇4.7H2〇 24g、CaCl2 20g、MnS〇4.5H2〇 lOg、维生素 B1 O.lg、苯甲醇0.5g，余量为水。
[0007] 所述的厚垣抱子样细胞的直径为9-15叫1，区别于直径约6化m的黄抱原毛平革菌厚 垣抱子(chlamydospore)。
[000引所述的固体发酵过程为:接种10-20mL黄抱原毛平革菌分生抱子悬液于每千克固 体发酵培养基中，其中黄抱原毛平革菌分生抱子悬液的抱子浓度为3X107个/mL，固体发酵 罐的溫度控制在33°C，静置发酵10天，发酵过程中每2小时揽拌一次。
[0009] 所述的玉米賴杆在使用之前进行粉碎处理，粉碎物于50°C烘箱中烘干后备用。
[0010] 所述的黄抱原毛平革菌为商业化菌株，购自美国典型培养物保藏中屯、，菌株编号 为ATCC24725。
[0011] 本发明W玉米賴杆为碳源来生产厚垣抱子样细胞，不仅可减轻賴杆焚烧对大气环 境造成的污染，提高废弃賴杆的利用率，而且产生的厚垣抱子样细胞还可作为生物制剂用 于环境治理、酶制剂发酵及农田上壤生物修复等领域。
【具体实施方式】
[0012] W下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于W下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。 实施例
[0013] 一、不同賴杆量对化C产量的影响 1、利用PDA(马铃馨葡萄糖琼脂培养基)平板培养P. chrysosporium，3-5天后，平板上 分生抱子用无菌水洗脱，适当稀释后，制备成浓度为3X107个/mL的分生抱子悬液。
[0014] 2、根据配方1 -3分别制备固体发酵培养基： 配方1:玉米賴杆粉碎物300g、酒石酸锭50g、K此P〇4 26g、MgS〇4.7出0 24g、CaCl2 20邑、 1记〇4'5出0 10邑、维生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至总重为化邑。
[0015] 配方2:玉米賴杆粉碎物400g、酒石酸锭50g、K此P〇4 26g、MgS〇4.7此0 24g、CaCl2 20邑、1记04'5出0 10邑、维生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至总重为化邑。
[0016] 配方3:玉米賴杆粉碎物500g、酒石酸锭50g、K此P〇4 26g、MgS〇4 · 7此0 24g、CaCl2 20邑、1记04'5出0 10邑、维生素 810.1邑、苯甲醇0.5邑，加水至总重为化邑。
[0017] 3、接种与发酵 固体发酵罐体积为2 L，装1 kg经灭菌的固体发酵培养基，发酵罐内接种15 mL P. chrysosporium分生抱子悬液(抱子浓度=3 X 107个/mL)，溫度控制在33°C，固体发酵过程中 每2小时揽拌一次，发酵时间为10天。
[001引 4、化村十数 利用平板菌落计数法测定CLC的数量，单位CRJ/g。
[0019] 二、实验结果 实验结果如表1所示，固体发酵10天后，玉米賴杆粉碎物含量为400g/kg时，P. ch巧sosporium的化C产量最高，为8.9X108 CFU/g。玉米賴杆粉碎物含量为300g/kg和 500g/kg时，CLC的产量略有下降，分别为6.5 X 1〇8 C即/g和7.4 X 1〇8 CFU/g。W上结果表明 玉米賴杆可W作为营养基质用于化C的固体发酵，玉米賴杆的不同用量对化C的产量具有一 定的影响。
[QQ2Q] 表1 不同玉米賴杆含量对化C产量的影响_
W上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在 不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，运些变化和改进均落入本发 明保护的范围内。
【主权项】
1. 一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸杆生产厚垣孢子样细胞的方法，其特征在 于:黄孢原毛平革菌利用玉米秸杆为碳源，通过固体发酵产生厚垣孢子样细胞，其中每千克 固体发酵培养基含以下成分:玉米秸杆粉碎物300-500g、酒石酸铵50g、KH 2P〇4 26g、MgS〇4 · 7H20 24g、CaCl2 20g、MnS〇4.5H20 10g、维生素 B1 O.lg、苯甲醇0.5g，余量为水。2. 根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸杆生产厚垣孢子样细胞 的方法，其特征在于:所述的厚垣孢子样细胞的直径为9-15 μπι。3. 根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸杆生产厚垣孢子样细 胞的方法，其特征在于:所述的固体发酵过程为接种10-20 mL黄孢原毛平革菌分生孢子悬 液于每千克固体发酵培养基中，其中黄孢原毛平革菌分生孢子悬液的孢子浓度为3 X107 个/mL，固体发酵罐的温度控制在33°C，静置发酵10天，发酵过程中每2小时搅拌一次。4. 根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸杆生产厚垣孢子样细胞 的方法，其特征在于:所述的玉米秸杆在使用之前进行粉碎处理，粉碎物于50°C烘箱中烘干 后备用。5. 根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸杆生产厚垣孢子样细胞 的方法，其特征在于:所述的黄孢原毛平革菌为商业化菌株，购自美国典型培养物保藏中 心，菌株编号为ATCC24725。
【专利摘要】本发明公开了一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法。本发明的技术方案要点为：黄孢原毛平革菌利用玉米秸秆为碳源，通过固体发酵产生厚垣孢子样细胞，其中每千克固体发酵培养基含以下成分：玉米秸秆粉碎物300-500g、酒石酸铵50g、KH2PO4？26g、MgSO4·7H2O？24g、CaCl2？20g、MnSO4·5H2O？10g、维生素B1？0.1g、苯甲醇0.5g，余量为水。本发明以玉米秸秆为碳源来生产厚垣孢子样细胞，不仅可减轻秸秆焚烧对大气环境造成的污染，提高废弃秸秆的利用率，而且产生的厚垣孢子样细胞还可作为生物制剂用于环境治理、酶制剂发酵及农田土壤生物修复等领域。
【IPC分类】C12R1/645, C12N3/00
【公开号】CN105543159
【申请号】CN201610117193
【发明人】王海磊, 王莹, 李平, 李祎, 刘磊
【申请人】河南师范大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月2日