从忽地笑鳞茎中分离筛选拮抗细菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治细菌领域，具体来说，涉及一种从忽地笑鳞茎中分离筛选拮抗细菌的方法。
【背景技术】
[0002]生活于健康植物组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌称为内生细菌，其中有些是病原菌的拮抗微生物。作为植物微生态系统的组成成员，某些内生细菌可通过产生抗生素、水解酶类等抗菌活性物质抑制病原菌。利用微生物防治植物真菌病害具有对环境无污染、对人畜无害、减缓病原菌耐药性的优点。研究人员已从水稻、棉花、番茄等植物中分离到拮抗细菌，其中有些己经进入实际应用阶段，并产生了一定的社会和环境效益。
[0003]水稻稻痕病是由稻痕病菌(Magnaportheoryzae)引起的病害，广泛分布于水稻各产区。全球因稻瘟病引起的水稻减产现象大幅增加，稻瘟病发病可造成水稻减产10%到30%，严重时可导致颗粒无收。采用抗病品种和化学杀菌剂仍是当前防治稻瘟病的主要方法，但是，存在的问题是抗稻瘟病水稻品种较单一、稻瘟病菌各生理小种较复杂且具有一定的变异性，而化学农药有一定的毒性，污染环境，且长期使用化学农药病原菌会产生抗药性。这些问题使水稻稻瘟病的防治受到一定限制，成为制约农业可持续发展的主要障碍。
[0004]忽地笑是石蒜科石蒜属的多年生草本植物，富含多种生物碱，具有较高的药用和生防应用价值，在石蒜属植物中寻找对环境友好、无毒害的生防微生物，作为化学农药的理想替代品是防治水稻稻瘟病等真菌病害的新途径。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种从忽地笑鳞茎中分离筛选拮抗细菌的方法，包括以下步骤:
(1)采集忽地笑鳞茎，自来水冲洗，切块，备用；
(2)用NaClO浸泡，然后用无菌水反复冲洗4次；
(3)将消毒后的单鳞片用刀片切成Icm2大小的小方块，放置在LB固体培养基上，30°C培养48h，长出的菌体转接至相同的培养基上划线纯化，直至纯化到单菌落，将纯化后所得的单菌落接至LB培养基斜面上保存；
(4)将斜面保存的菌株接入LB液体培养基30°C震荡培养，活化后与供试病原真菌进行对峙培养；
(5)通过观察有无抑菌圈，挑选出可拮抗病原真菌的内生细菌。
[0006]在一个具体的实施方式中，步骤(I)为取生长状况良好的忽地笑鳞茎，自来水冲洗，剥去黑褐色外层，切除根部，留取鳞茎中部(约1/3)，并将其切成4块。
[0007]在一个具体的实施方式中，步骤(2)为将切好的鳞茎放入三角瓶中，用NaClO浸泡15min，在浸泡的过程中不断轻轻搅动鳞茎块，然后用无菌水反复冲洗4次，晾干，备用。
[0008]在一个具体的实施方式中，步骤(3)为将表面消毒后的鳞茎切成Icm2的鳞茎小块，用灭过菌的镊子将切好的鳞茎小块贴放到LB固体培养基上，每皿均匀摆放4块，放入培养箱中，30°C培养48h后将长出的菌落转接至LB固体培养基上，进行划线纯化，30°C培养48h，将纯化后所得的单菌落接至相应培养基斜面上，4°C冰箱保存。
[0009]在一个具体的实施方式中，步骤(4)为将保存于斜面试管中的细菌菌株转接到LB液体培养基中，30°C震荡培养。用无菌打孔器打取直径为6mm的供试菌水稻稻瘟病菌菌饼，置于直径为90mm的PDA平板中央，培养2-3d后，在围绕菌饼十字交叉的四个角落的分别接种经过纯化的内生细菌菌株，进行对峙培养，于28°C培养5-6d，以只接病原菌，不接分离菌株为对照。
[0010]在一个具体的实施方式中，PDA培养基配方为马铃薯200g/L，葡萄糖或蔗糖10g/L，琼脂15g/L。
[0011]在一个具体的实施方式中，LB培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl1g/1^，琼脂158/1。
[0012]本发明的拮抗细菌分离筛选方法具有以下优点:本发明方法很容易得到新的拮抗细菌菌株，分离到的菌株HDXY是从忽地笑鳞茎中筛选获得的，其对稻瘟病菌具有十分明显的拮抗作用；菌株HDXY生长周期短，环境要求低，有利于扩大培养，为水稻稻瘟病生物防治提供基础准备。
【附图说明】
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[0013]图1为拮抗细菌HDXY与供试稻瘟病菌的对峙图。
[0014]图2为拮抗细菌的菌落形态。
【具体实施方式】
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[0015]以下作为实施例对本发明的方法进一步说明，将有助于对本发明的进一步的理解，本发明的保护范围不受这些实施例的限定，其保护范围由权利要求书决定。
[0016]实施例1
[0017]从忽地笑鳞茎中分离筛选鉴定拮抗细菌的方法具体包含下列步骤:
I采集不同地区忽地笑，放入塑料袋保存中并记录
2材料表面消毒与拮抗细菌分离 2.1鳞茎处理
取生长状况良好的鳞茎，自来水冲洗，剥去黑褐色外层，切除根部，切留鳞茎中部(约I/3)，并将其切成4块，备用。
2.2表面消毒
将切好的鳞茎放入三角瓶中，用NaC 1浸泡15mi η，在浸泡的过程中不断轻轻搅动鳞茎块，然后用无菌水反复冲洗4次，晾干，备用。
2.3细菌分离培养
将表面消毒后的鳞茎切成Icm2的鳞茎小块，用灭过菌的镊子将切好的鳞茎小块贴放到LB固体培养基上，每皿均匀摆放4块，放入培养箱中，30°C培养，48h后将长出的菌落转接至LB固体培养基上，进行划线纯化，30°C培养48h，将纯化后所得的单菌落接至相应培养基斜面上，4°C冰箱保存。 3拮抗细菌的筛选
将放置于4°C冰箱中的斜面试管取出，转接到LB液体培养基中，30°C震荡培养。用无菌打孔器打取直径为6mm的供试水稻稻瘟病菌菌饼，置于直径为90mm的TOA平板中央，培养2-3d后，在围绕菌饼十字交叉的四个角落的分别接种活化后的内生细菌菌株，进行对峙培养，28°C培养5-6d。以只接病原菌，不接分离菌株为对照，观察所分离的细菌菌株对供试水稻稻瘟病菌的抑菌作用。
4抑菌谱检测
从图1中可以看出，筛选到的拮抗细菌HDXY与稻瘟病菌多个生理小种对峙培养均可见明显的抑菌现象。另外，措抗细菌HDXY对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、烟曲霉(Aspergillus funigatus)和白色念珠菌(Candida Albicans)也有抑制作用。
5形态学特征
将待鉴定拮抗细菌在LB平板上划线，30°C培养48h，观察菌落形态并记录。HDXY菌落呈圆形、淡黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明(图2)。
挑取LB平板上30°C培养48h的待鉴定拮抗菌进行革兰氏染色，1000倍光镜显微观察其菌体，并记录观察结果。菌株HDXY革兰氏染色为阴性，显微镜下菌体呈直或微弯曲杆状，具1-3根鞭毛。
516S rDNA基因扩增及序列分析
提取菌株基因组DNA作为模板，采用细菌通用引物PCR扩增其16S rDNA片段。取PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物回收纯化，送上海英骏生物技术有限公司测序。
PCR所用引物为:16S-27: 5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；16 S-1492:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应体系(25yL):稀释DNA模板lyL;dNTP 2yL;引物 16S_271yL;引物 16S_14921yL;10XPCR Buffer 2.5yL；Taq DNA聚合酶0.2yL;灭菌超纯水补足至25yL。
PCR 反应条件:94°C5min ； 94°C30s，52°C30s，72°Clmin，30 个循环；72°C 1min，4°C 保存。PCR产物经试剂盒纯化后测序。
[0018]根据菌株形态及培养特征和16SrDNA基因序列分析，将菌株HDXY鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glad1li)。
[0019]伯克霍尔德氏菌作为多种病原菌的拮抗菌，是一类重要的生防菌。利用生防菌制备微生物制剂来防治病害可以大幅度的减少化学农药对环境带来的污染，同时达到控制病害发生的目的。分离出拮抗菌是制备微生物制剂的前提，也为更好的开展真菌病害的生物防治做出了准备。
【主权项】
1.一种从忽地笑鳞茎中分离筛选拮细菌的方法，包括以下步骤: (I)取生长状况良好的忽地笑鳞茎，自来水冲洗，剥去黑褐色外层，切除根部，切留鳞茎中部(约1/3)，并将其切成4块； (2 )用NaCl O浸泡，然后用无菌水反复冲洗4次； (3)将消毒后的单鳞片用刀片切成Icm大小的小方块，将切好的鳞茎放在LB固体培养基上，30°C培养48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，30°C培养48h后划线纯化，直至纯化到单菌落，将纯化后所得的单菌落接至LB培养基斜面上保存； (4)将斜面保存的菌株接入LB液体培养基30°C震荡培养，活化后与供试稻瘟病菌在I3DA固体培养基上进行对峙培养； (5)通过观察有无抑菌圈，挑选出现抑菌圈的可拮抗稻瘟病菌的内生细菌。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述LB液体培养基配方为:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L和NaCl 10g/L，调整pH为7，在上述配方中加入15 g/L的琼脂即为LB固体培养基;PDA固体培养基配方为:马铃薯200 g/L，葡萄糖或蔗糖10 g/L，琼脂15 g/L ο3.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)的对峙培养为:将供试稻瘟病菌用无菌打孔器打取直径为6_的菌饼，置于直径为90mm的PDA固体培养基中央，培养2_3 d后，再在稻瘟病菌菌饼十字交叉的角落分别接种4株分离到的内生细菌。
【专利摘要】本发明涉及一种从忽地笑鳞茎中分离筛选拮抗内生细菌的方法，该方法通过内生菌分离方法从忽地笑鳞茎中分离得到内生细菌，采用改进的对峙培养方法，将供试稻瘟病菌点在平板中央，培养2-3天，再在围绕稻瘟病菌十字交叉的四个角落分别接种4个细菌菌株，培养5-6天，观察有抑菌效果的即为筛选获得的拮抗细菌。获得一株对水稻稻瘟病菌有明显抑制作用的拮抗细菌，抑菌谱实验证明其对小麦赤霉病菌、烟曲霉和白色念珠菌也有抑制作用。本发明能显著提高筛选效率，所分离到的拮抗细菌可作生防菌，制成微生物制剂，为病害生物防治提供基础。
【IPC分类】C12N1/02, C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105524871
【申请号】CN201610064924
【发明人】李晓丹, 汪仁, 夏冰, 程丽
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月29日