及其分子诊断方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及抗性品种选育技术领域，更具体地，设及鸡B亚群禽白血病抗性分子标 记tvb3667-3668insAG及其分子诊断方法。
【背景技术】
[0002] 禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的一种免疫抑制 性肿瘤性传染病，该病能引起多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。感染鸡的禽白血病病毒 包括ALV A-E和J共6个亚群。B亚群禽白血病病毒(ALV-B)是我国禽白血病的主要病原之一， 能使感染鸡群发生免疫抑制、生产性能下降及特征性肿瘤而死亡，给世界养禽业造成巨大 的经济损失。目前，该病尚无商品化疫苗和有效的治疗方法，主要通过淘汰阳性鸡来净化种 鸡群和加强生物安全措施进行预防。然而，现有措施并不能控制A化-B在中国的发生与流 行。近年的流行病学调查结果显示，4￥心8在我国商品肉鸡、蛋鸡、地方品系鸡和野生鸟类中 普遍存在，已成为威胁我国养鸡业(尤其是种鸡业)持续健康发展的重大疾病之一。因此，急 需研发更适合我国实情的禽白血病防控新策略。国外已有研究证实，从宿主遗传抗性方面 研究禽白血病的遗传抗病育种已成为防控该病的有效策略。
[0003] 发掘禽白血病遗传抗性功能基因或基因位点，并应用于筛选禽白血病遗传抗性特 异种质W培育禽白血病抗性鸡品种(系)是实现禽白血病遗传抗病育种的关键。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记。 [000引本发明的另一个目的是提供一种诊断B亚群禽白血病抗性鸡的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明是通过W下方案予W实现的： 一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记，所述分子标记为tvb受体基因第3667与3668的AG 插入突变。该位点简称为tvb3667^3668insA<=突变位点。
[0007] 本发明首次分析了中国鸡种tvb受体基因的遗传变异，发现中国鸡种中tvb受体基 因第3667与3668位存在AG插入突变，发明人从体外、体内实验两个层面证实了该自然突变 引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。具体原因在于tvb受体基因第3667与3668位存在AG 插入突变位于tvb受体基因第4外显子，从而导致tvb受体基因发生移位编码，推测其可能导 致tvb受体基因表达一个不适宜作为病毒受体的缺陷蛋白，从而引起宿主对ALV-B的感染产 生遗传抗性。
[0008] 因此，本发明保护如上所述分子标记在诊断B亚群禽白血病抗性鸡中的应用。
[0009] 依据tvb受体基因第3667与3668的AG插入突变，本发明建立了一种诊断B亚群禽白 血病抗性鸡的方法，具体包括如下步骤： S1.提取待测鸡血液DNA，WSEQ ID ^):7~8所示？4引物扩增包含1￥133667-36681。3^突变 位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型； S2 .如待测鸡的基因型为tvbinsAG/insAG，则为B亚群禽白血病抗性鸡，如待测鸡的基因型 为tvbS/insAG或tvbS/S，则为B亚群禽白血病易感性鸡。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明首次发现在中国鸡种中tvb受体基因第3667与3668位存在AG插入突变，而且本 发明首次验证该突变引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性。因此，将该突变位点作为鉴定 鸡B亚群禽白血病抗性的分子标记是非常准确的。W此突变位点建立的抗B亚群禽白血病遗 传标记的分子诊断方法，可应用于筛选ALV-B遗传抗性鸡品种（系）的育种素材，从而开展 ALV-B遗传抗性鸡品种(系）的选育。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明的研究思路。
[001引图2为RCASBP ( B )病毒感染tvb3667-3668insAG位点不同基因型CEF细胞。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0014] 实施例1tvb受体基因的遗传变异分析 根据tvb受体基因已知DNA序列(GenBank登录号:NC_006109.3)，设计5对引物扩增tvb 基因全长序列5425bp，引物序列、位置及PCR扩增片段大小如表1所示。
[001引表1为tvb受体基因全长序列PCR扩增信息
提取中国鸡种血液样品的基因组DNA，用该5对引物扩增tvb受体基因全长序列。PCR反 应体系组成:模板lyLaOXbuffer 2.5yL，dNTPs 2化，上下游引物各1 yL，K0D-FX 0.25 yL，无菌水补至25yLDPCR反应程序:94°C预变性3min，1个循环;94°C 45s，58~65°C(不同引 物退火溫度）90s，72°C 603,35个循环;72°(3后延伸10111111。？0?产物在2%琼脂糖凝胶电泳检 巧耐可观察到P1~P5引物各自扩增的特异性条带，将PCR扩增产物进行克隆测序，分析tvb 受体基因的遗传变异。发明人随机分析了多个中国鸡品种(系)tvb受体基因的遗传变异，发 现中国鸡种tvb受体基因第3667与3668核巧酸位置中存在AG插入突变（简称tvb 3667 -3668insAG)
[0016] 实施例2 tvb3667-3668insAG突变致宿主抗alv-b感染的功能验证。
[0017] 1、体外细胞的功能验证:构建RCASBP(B)EGFP表达质粒，转染DF-I细胞7天后，收集 细胞上清液(上清液含携带EGFP巧光蛋白的RCASBP(B)病毒，即ALV-B病毒，可随后感染DF-I 和CEF细胞），测定病毒感染单位（IU)后，分装保存于-80°CdRCASBP(B)病毒感染tvb3667 -ssssinsAG突变位点不同基因型CEF，包括野生型tvb S/S CEF(对ALV-B易感）、杂合突变型tvbS /insAGcEF W及纯合突变型tvbinsAG/insAG ceF，感染后1、2、4、7天，利用流式细胞技术检测不同 时间点tvb3667^668insW突变不同基因型CEF感染RCASBP(B)病毒后的阳性细胞率，确定 tvb3667-3668insAG突变不同基因型C邸体外感染rcaSBP(B化GFP病毒的趋势。体外细胞实验结果 表明：野生型tvbW CEF和杂合突变型tvbWnsAGcEF对ALV-B易感，而纯合突变型tvbinsAG/ insAGcEF抗ALV-B的感染，证实tvb受体基因自然突变tvb3667-3668insAG导致宿主抗ALV-B的感 染，见图2。
[0018] 2、体内攻毒试验的功能验证:携带tvb3667^3668insw突变位点不同基因型的小鸡随机 分组，饲养于隔离器，1日龄和5日龄分别腹腔注射等量ALV-B野毒。体内攻ALV-B野毒1个月 后，采集tvb 3667-3668insAG突变位点不同基因型鸡的血样，利用TRIZ化试剂盒抽提血样总RNA。 RT-PCR扩增ALV-B的env基因编码序列，设计ALV-B-env的RT-PCR扩增上游引物和下游引物： env-F:5 '- CCTGGAAAGGTGAGCAAG-3 '； env-R:5 '- TGGAGGGAGAATCGTGAA-3 '； RT-PCR扩增片段长度为966bp。利用PrimeScriptROne Step RT-PCR Kit Ver. 2试剂 盒进行RT-PCR扩增，PCR反应程序：50°C 反转录30 min;94°C 30s，56°C 60s，72°C 60s，30 个循环;72°C后延伸lOminJCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测，如观察至Ij966bp的目的条带， 则该样品发生病毒血症(ALV-B阳性），如无目的条带的扩增，则该样品没有发生病毒血症 (ALV-B阴性）。体内攻毒试验结果表明：tvb 3667-3668insAG突变位点野生型tvbW小鸡（16只）攻 ALV-B野毒后均为ALV-B阳性，杂合突变型tvbWnsAG小鸡（26只）攻ALV-B野毒后也均为ALV-B 阳性，而纯合突变型tvbinsAWnsAG小鸡（18只）攻ALV-B野毒后均为ALV-B阴性，见表2。
[0019] 表2为tvb3667^3668insA唉变位点不同基因型旧龄小鸡 攻ALV-B野毒1个月后ALV-B阳性率
备注:ALV-B为B亚群禽白血病病毒(下同） 实施例3建立ALV-B遗传抗性鸡的鉴定标准 利用表1中的P4引物PCR扩增包含tvb3667^3668insA唉变位点的tvb受体基因区域，根据P4 引物PCR扩增产物测序结果，制定判定B亚群禽白血病遗传抗性鸡的方法标准(见表3)。 [0020]表3 B亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准
备注:如果被检测的鸡带有A，则运只鸡判定为对ALV-B的感染产生遗传抗性。
[0021 ]建立的B亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准为：1、假如某只鸡在tvb3667-3668insAG 突变位点的基因型为tvbinsAWnsAG，则运只鸡对alV-B感染产生遗传抗性。
[0022]实施例4 ALV-B遗传抗性鸡的筛选与运用 用建立的B亚群禽白血病遗传抗性鸡鉴定方法评估10个地方鸡种和8个商业肉鸡品系 共989个样品抗ALV-B的遗传改良潜力，结果见表4。表4结果表明康乐鸡、东乡绿壳蛋鸡、宁 都黄鸡和济宁百日鸡等地方鸡种W及C01、C03和C08等商业肉鸡品系具有良好的抗ALV-B遗 传改良潜力，可从运些品种（系）中筛选出培育抗ALV-B感染的育种素材，并运用于ALV-B遗 传抗性鸡品种(系）的选育，W防控B亚群禽白血病。
[002引表4中国鸡种tvb3667^668insAG突变位点的基因型频率
备注:CBOl- CB08等代表8个商业肉鸡品系。
[0024]表4的结果表明，tvb受体基因第3667与3668核巧酸位置中存在AG插入突变只存在 部分鸡品种（系）中，而且，即使是同一鸡品种(系），也不是所有的鸡都是发生突变的。例如 检测的52只康乐鸡，其中26只是没有突变的，剩下的26中，有一些是纯合突变，而一些是杂 合突变。
【主权项】
1. 鸡B亚群禽白血病抗性分子标记，其特征在于，所述分子标记为tvb受体基因第3667 与3668位的AG插入突变。2. 权利要求1所述的分子标记在诊断B亚群禽白血病抗性鸡中的应用。3. -种诊断B亚群禽白血病抗性鸡的方法，其特征在于，包括如下步骤：51. 提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID N0:7~8所示P4引物扩增包含tvb3667-3668insAG突变位 点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型；52. 如待测鸡的基因型为tvbinsAGAnsAG，则为B亚群禽白血病抗性鸡，如待测鸡的基因型 为tvb sAnsAG或tvbsA，则为B亚群禽白血病易感性鸡。
【专利摘要】本发明属于抗性品种选育技术领域，具体公开了一种鸡B亚群禽白血病抗性分子标记<i>tvb</i>3667-3668insAG及其分子诊断方法。本发明首次分析了中国鸡种<i>tvb</i>受体基因的遗传变异，发现中国鸡种中<i>tvb</i>受体基因第3667与3668位存在AG插入突变，发明人从体外、体内实验两个层面证实了该自然突变引起宿主对ALV-B的感染产生遗传抗性，另外发明人以此建立抗B亚群禽白血病遗传标记的分子诊断方法，该方法可应用于筛选ALV-B遗传抗性鸡品种（系）的育种素材，从而开展ALV-B遗传抗性鸡品种（系）的选育。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105506088
【申请号】CN201511005988
【发明人】谢青梅, 陈伟国, 蔺文成, 舒鼎铭, 李昕键
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日