一种与梨黑斑病抗性相关的snp标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于果树分子遗传育种技术领域，提供了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，可用于砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种，以提高砂梨抗病育种效率，适用于从事梨科研、育种及生产的科研单位和公司。
【背景技术】
[0002]梨黑斑病病原为半知菌亚门链格胞属的菊池链格胞(Alternaria kikuchianaTanaka)。病菌以分生孢子和菌丝体在被害枝梢、病叶、病果和落于地面的病残体上越冬。第二年春季产生分生孢子后借风雨传播，从气孔、皮孔和直接侵入寄主组织引起初侵染。初侵染发病后病菌可在田间引起再侵染。一般4月下旬开始发病，嫩叶极易受害。6?7月如遇多雨，更易流行。主要危害果实、叶片和新梢，常引起早期落叶和嫩梢枯死，致使裂果和早期落果，严重削弱树势。目前生产中主要采用化学药剂防治。使用化学药剂防治不仅浪费人力物力，污染环境，还使果实农药残留增加。
[0003]随着分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术大大加快了抗病育种的进程，显著缩短了抗病新品系的选育周期。分子育种的前提是获得与目标性状密切相关的分子标记或功能基因。利用分子标记辅助选择目标性状，可提高选择效率，缩短育种周期。虽然黑斑病是重要的病害之一，然而对于抗黑斑病基因的定位研究相对薄弱。目前的报道主要集中于梨黑斑病的接种鉴定，尚未有SNP标记用于梨育种性状辅助选择的报道。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种与梨黑斑病抗性连锁的SNP标记及应用。
[0005]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
一种与梨黑斑病抗性相关的SNP标记，其位于梨基因组S83.0_275630处碱基为T则为抗黑斑病，为C则为感黑斑病。
[0006]用于检测权利要求1所述与梨黑斑病抗性相关的SNP标记的引物对，正向引物S83-F, SEQ ID 从).1，反向引物583-1?，SEQ ID N0.2。
[0007]—种用于鉴定砂梨品种黑斑病的SNP标记的方法，包括如下步骤:
1)提取待测梨基因组DNA;
2)以待测梨的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物;经序列比对在S83.0_275630处碱基为鉴定砂梨品种黑斑病的高感品种或尚抗品种的SNP标记；
其中步骤2)中的PCR扩增体系总体积为20μ1，包括10 ng/μ?模板DNA 2μ1，2 XEs TaqMasterMix 10μ1，10 mM正反引物各2μ1 和 H2O 4μ1 ；
所述引物对为正向引物S83-F，SEQ ID N0.1，反向引物S83-R，SEQ ID N0.2；
PCR扩增程序为:94 °C预变性3 min;94 °C变性30 S，退火温度60 °C持续45 S，72 0C延伸60 s，35个循环;最后72 °C延伸10 min； 上述喊基为T的基因型则为尚感品种，该处喊基为C的基因型为尚抗品种。
[0008]进一步地，上述的SNP标记在梨分子标记辅助育种中的应用。
[0009]上述的应用，利用梨基因组DNA，采用引物对为正向引物S83-F，SEQ ID N0.1，反向引物S83-R，SEQ ID勵.2进行?0財广增程序，如经序列比对在383.0_275630处碱基为1'的基因型则为尚感品种，该处喊基为C的基因型为尚抗品种。
[0010]有益效果:
本发明利用基于Super-BSA策略筛选到与梨黑斑病连锁的SNP标记可用于梨抗黑斑病杂交育种后代的早期辅助选择，与传统的田间自然发病观察相比，可不受环境条件影响，排除人为因素干扰，结果更加准确可靠。与接种鉴定黑斑病抗性相比，免去了病原菌的分离、培养和接种鉴定等繁杂的程序，操作更为便捷，加快梨高抗黑斑病新品种的育种进程。
【附图说明】
[0011]图1梨Fl代不同的黑斑病抗性性状分离
图2双亲及抗感混池在目标SNP位点的序列比对。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
与梨黑斑病抗性连锁的SNP标记的开发，是通过以下方式获得的:
1、筛选梨抗感材料，构建梨黑斑病抗性遗传研究群体
选取经过多年田间自然发病调查和人工接种鉴定筛选到的梨高抗黑斑病品种‘金晶’和高感黑斑病品种‘红粉’作为亲本进行杂交，获得341株Fl代单株。
[0013]2、梨黑斑病抗性接种鉴定
选择叶龄一致、刚完全展开的新梢嫩叶进行接种。每个单株接种2片，做3次重复。菌株经过筛选确定为产孢量大、致病力强、分布较为广泛的H菌株，孢子浓度为5 X 15 /ml，喷雾接种。25°C保湿5天后调查发病情况(图2)。根据病情指数进行分级。
[00M] 3、基于集团混合分析法(Bulked segregating Analysis)策略筛选梨黑斑病抗性连锁标记
根据发病调查结果选择高抗和高感单株各60份，采样CTAB法分别提取每个单株的基因组DNA，等量混合，分别建立抗病基因混池和感病基因混池。采用SLAF-seq(Specific-LocusAmplified Fragment Sequencing)技术对Fl遗传分离群体(2个亲本和60+60的极端性状混池)进行测序，使用GATK软件工具包对亲本和子代混池的SNP位点进行检测和过滤，然后采用BSA进行关联分析，最终获得I个SNP位点即scaf f old83.0_275630。根据引物设计原则，采用Primer软件设计引物，其上游正向SEQ IDN0.1)和下游反向引物5’- GATGCTGGCTTATGTGCTGA-3' (S83-R, SEQ ID N0.2)。扩增产物大小为Si^bpt3PCR扩增体系总体积为20μ1，包括10 ng基因组模板DNA 2μ1，2 XEs TaqMasterMix 10μ1，10 mM正反引物各2μ1和H2O 4μ1。扩增程序为94 °C预变性3 min；94。。变性30 S，退火温度60 °C持续45 S，72 °C延伸60 S，35个循环；最后72 °C延伸10 min。利用该引物在‘金晶’‘红粉’、抗池和感池中均成功扩增，PCR产物进行测序分析。经序列比对发现‘红粉’和感池在S83.0_275630处碱基为T，而‘金晶’和抗池在该处碱基则为C(图2)。
【主权项】
1.一种与梨黑斑病抗性相关的SNP标记，其特征在于，其位于梨基因组S83.0_275630处碱基为T则为抗黑斑病，为C则为感黑斑病。2.用于检测权利要求1所述与梨黑斑病抗性相关的SNP标记的引物对，其特征在于: 正向引物S83-F, SEQ ID N0.1, 反向引物S83-R, SEQ ID N0.2。3.一种用于鉴定砂梨品种黑斑病的SNP标记的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提取待测梨基因组DNA; 2)以待测梨的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应； 3)检测PCR扩增产物;经序列比对在S83.0_275630处碱基为鉴定砂梨品种黑斑病的高感品种或尚抗品种的SNP标记； 其中步骤2)中的PCR扩增体系总体积为20μ1，包括10 ng/μ?模板DNA 2μ1，2XEs TaqMasterMix 10μ1，10 mM正反引物各2μ1 和 H2O 4μ1 ； 所述引物对为正向引物S83-F，SEQ ID N0.1，反向引物S83-R，SEQ ID N0.2； PCR扩增程序为:94 °C预变性3 min；94 °C变性30 s，退火温度60 °C持续45 S，72 0C延伸60 s，35个循环;最后72 °C延伸10 min； 其中所述喊基为T的基因型则为尚感品种，该处喊基为C的基因型为尚抗品种。4.如权利要求3所述的方法在梨分子标记辅助育种中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，利用梨基因组DNA，采用引物对为正向引物S83-F, SEQ ID N0.1，反向引物S83-R，SEQ ID N0.2进行PCR扩增程序，如经序列比对在S83.0_275630处碱基为T的基因型则为高感品种，该处碱基为C的基因型为高抗品种。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定砂梨品种黑斑病的SNP标记，属于果树分子遗传育种技术领域，包括如下步骤：1）提取待测梨基因组DNA；？2）以待测梨的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应；3）检测PCR扩增产物；经序列比对在S83.0_275630处碱基为鉴定砂梨品种黑斑病的高感品种或高抗品种的SNP标记；引物对为正向引物S83-F,？SEQ？ID？NO.1，反向引物S83-R,？SEQ？ID？NO.2。使用本方法筛选的鉴定砂梨品种抗黑斑病的SNP分子标记可以为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105506075
【申请号】CN201510910376
【发明人】胡红菊, 张靖国, 孙中海, 杨晓平, 陈启亮, 范净
【申请人】湖北省农业科学院果树茶叶研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月10日