一种蜂毒素的制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及蛋白质生物合成技术领域，具体属于一种采用生物工程技术高效制备蜂毒素(melittin)的方法。
技术背景:
[0002]蜂毒素又名蜂毒肽，是意大利蜜蜂(Apis mellificera)蜂毒的主要活性成分。该小肽由26个氨基酸残基组成，具有很好的水溶性，相对分子量约为2.8KDa，不含有二硫键。它的氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2，碱性氨基酸主要集中在肽段的C末端(KRKR)。蜂毒素可以通过多种途径影响细胞的信号传导过程;具有诱导细胞凋亡、抗菌、抗病毒以及直接杀伤、免疫调节，诱导细胞凋亡、抑制转移和血管生成等抗肿瘤等作用。此夕卜，蜂毒素制成的针剂对治疗高血压、风湿类风湿性关节炎、畸形脊椎炎、外周神经炎、肌肉炎、神经痛、偏头痛、坐骨神经痛、外周血管粥样硬化等均有明显的疗效。蜂毒素是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍。
[0003]近年来，随着对各种发病机理研究的不断深入，对蜂毒素治疗疾病机理的研究也在不断深入。由于蜂毒素分子量比较小(2.8KD)而无法获取足量的高纯度肽，从而阻止了人们对其在疾病治疗中的确切机理研究。
[0004]目前，获取蜂毒素的途径主要有两种:一是从蜜蜂中提取[刘岭，凌昌全，黄雪强，蜂毒素的纯化方法及体外抗肿瘤作用研究，中国生化药物杂志，2003年24卷，4期，163-168。]，但是这种方法提取得到的量很少，由于蜜蜂数量以及其本身重量的限制变得几乎不可能。第二种途径是固相合成，这种方法获得肽的成本比较高。由于蜂毒素的N端具有疏水性，可以插入到细胞质膜使得细菌死亡，因此蜂毒素本身具有一定的毒性而无法直接通过基因工程方法获取。到目前为止，还没有低成本、高效率制备蜂毒素的报道。
【发明内容】
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[0005]本发明旨在建立一种操作简单，低成本、高产率、高纯度蜂毒素(melittin)的制备方法。
[0006]本发明提供了一种蜂毒素的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0007](I)将I丐调蛋白(calmodulin)、smt3以及蜂毒素的核苷酸序列与表达载体形成的重组质粒转入大肠杆菌菌株；
[0008](2)将(I)所得菌株接种于改进后的TB培养基，IPTG诱导过夜表达；
[0009 ] (3)将(2)所得菌体通过超声破碎、离心、上清经过N 1-NTA亲和层析，sumo蛋白酶酶切，在1.0mM EDTA存在下再次经过N1-NTA亲和层析以及Sephadex G-25分子筛分离获得目标肽。
[0010]本发明方法中，步骤(I)中所述的表达载体可以是pMAL-c2x、pET28a或者pET_30a。[0011 ] 本发明方法中，步骤(I)中所表述的宿主菌可以是BL21 (DE3)plysS、Transsetta(DE3)或Transsetta(DE3)PIysSο
[0012]本发明方法中，步骤(3)中超声破碎可用反复冻融法或溶菌酶酶解替代。
[0013]本发明方法中，步骤(2)中改进后的TB培养基组分包括:蛋白胨(12g/L)、酵母提取物(24g/L)，甘油(10mL/L)，磷酸盐(0.1mM)，葡萄糖(5g/L)。
[0014]本发明方法中，引入钙调蛋白(calmodulin)基因的原因是钙调蛋白与蜂毒素之间存在高亲和力(?17M.1),可形成稳定的复合物。与蜂毒素结合后将肽被包结在蛋白的疏水性空腔内，避免了蜂毒素与细菌的直接接触，从而减小了蜂毒素对细胞的毒性;另外，在钙调蛋白与蜂毒素之间加入smt3基因目的是使得sumo蛋白酶酶切复合物calmodulin-smt3-melittin后的产物蜂毒素氨基酸数量依旧是26个。通常使用ppase、TEV等工具酶酶切后会或多或少引入多余氨基酸，从而改变目标蛋白氨基酸数目，而sumo酶是通过识别smt3结构域而进行切割的，经sumo酶酶切后的产物不改变原有蛋白或靶肽的氨基酸数目。因此，本文采用sumo酶切割小肽与蛋白形成的复合物，以此得到目标肽。另外，蜂毒素与钙调蛋白的结合需要Η)ΤΑ存在，因此，本发明在sumo酶切复合物后需要加入1.0mM才可以使得蜂毒素从钙调蛋白疏水空腔中释放出来。
[0015]本发明方法中，步骤(3)为肽的分离与纯化。采用常规方法分离蜂毒素，本发明还采用效果较好的N1-NTA层析填料等技术分离纯化肽。由于表达的融合蛋白带有组氨酸标签，本发明采用N1-NTA柱来纯化，其亲和层析特异性比较高，所以纯化效果比较好。本发明在钙调蛋白与蜂毒素之间插入smt3的目的是为了维持经sumo酶切后的蜂毒素的氨基酸个数仍为26。
【附图说明】
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[0016]图1本发明中calmodu I in (普通字体)_smt3 (加粗字体)-me I i tt in (斜体字体)氨基酸序列
[0017]图2本发明检测蜂毒素的SDS-PAGE结果
[0018]图3本发明蜂毒素经Sephadex G_25分子筛层析图
【具体实施方式】
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[0019]本发明以下实施例中所使用试剂以及耗材来源如下:
[0020]宿主菌Transsetta(DE3)plysS购于trans基因有限公司
[0021]二氯化镍购于国药集团化学有限公司
[0022]N1-NTA层析填料、小量质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒购自Qiagen公司
[0023]溶菌酶(Iysozyme)、DNase 1、氨节青霉素、苯甲基磺酰氟(PMSF)、异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、β_巯基乙醇、DIT购于上海生工。
[0024]内切酶、s umo酶等生化试剂购于Takar a公司。
[0025]蛋白胨、酵母提取物购自于0X0ID公司。
[0026]实施例1
[0027]首先，通过基因工程技术将钙调蛋白与smt3、蜂毒素的碱基序列构建到表到载体pET-30a上，从而得到重组质粒。基因测序结果正确后证明我们成功构建得到了pET-30a-calmodulin-smt3-melittin的表达质粒。基因序列翻译为蛋白序列见图1。
[0028]以TranSSetta(DE3)pLySS为宿主菌转化后挑取单菌落，在LB培养基中过夜培养，按1:100的比例接菌到500mL改进后的TB培养基中，37°C培养至OD?0.6，加入IPTG终浓度为
0.lmM、20°C过夜诱导，12h后离心、收集菌体。将菌体按照5mL/g湿菌重新悬浮于buffer A(50mM Tris,200mM NaCl，5πιΜβ-巯基乙醇，pH 8.0)，加入少量溶菌酶、DNaseI以及PMSF(终浓度为1.0mM)，4°C搅拌半小时后超声破碎菌体，经过14000rpm 4°C离心40min，取上清经N1-NTA亲和层析，用含有不同浓度咪唑的buffer A洗脱杂质蛋白，最后用含有200mM咪唑的buffer A洗涤目标蛋白并收集。超滤浓缩目标蛋白后经过G-25脱盐除去咪唑后，加入sumo蛋白酶4°C过夜酶切产物，在1.0mM EDTA存在下再次经N1-NTA亲和层析(图2)以及SephadexG-25分子筛分离目标肽(图3)，获得95%高纯度的蜂毒素。
【主权项】
1.一种蜂毒素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将I丐调蛋白(calmodulin)、smt3(SUM0family protein)以及蜂毒素(melittin)的核苷酸序列与表达载体形成的重组质粒转入大肠杆菌菌株； (2)将(I)所得菌株接种于TB培养基或改进后的TB培养基，IPTG诱导过夜表达； (3)将(2)所得菌体通过超声破碎、离心、上清经过N1-NTA亲和层析，sumo蛋白酶酶切，在1.0mM EDTA存在下再次经过N1-NTA亲和层析以及Sephadex G-25分子筛分离获得目标肽。2.如权利要求1所述的一种蜂毒素的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述的表达载体是 pMAL-c2x、pET28a 或者 pET-30a。3.如权利要求1所述的一种蜂毒素的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所表述的宿主菌是 BL21 (DE3) P IysS、Transsetta (DE3)或 Transsetta (DE3) P IysS ο4.如权利要求1所述的一种蜂毒素的制备方法，其特征在于，步骤(3)中超声破碎可用反复冻融法或溶菌酶酶解替代。5.如权利要求1所述的一种蜂毒素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中改进后的TB培养基组分包括:蛋白胨(12g/L)、酵母提取物(24g/L)，甘油(10mL/L)，磷酸盐(0.lmM)，葡萄糖(5g/L)。
【专利摘要】本发明涉及蛋白质合成技术领域，具体是一种蜂毒素的制备方法。本发明方法步骤如下：(1)将钙调蛋白、smt3(SUMO？family？protein)以及蜂毒素三者核苷酸序列与表达载体组成的重组质粒转入大肠杆菌菌株；(2)将(1)所得菌株接种于TB培养基或改进后的TB培养基，IPTG过夜诱导表达；(3)将(2)所得菌体超声破碎、离心，上清经Ni-NTA亲和层析、sumo蛋白酶酶切，在1.0mM？EDTA存在下再次经Ni-NTA亲和层析以及Sephadex？G-25分子筛分离获得纯度高达95％的蜂毒素，产量可达每升菌体16mg蜂毒素。本方法能克服目前蜂毒素产量低、成本高、无法满足对蜂毒素应用需求的缺陷，是目前高产量、低成本的表达方法。
【IPC分类】C12N15/70, C07K14/435
【公开号】CN105505970
【申请号】CN201610021184
【发明人】赵亚琴, 杨斌盛
【申请人】山西大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月13日