一种卷曲霉素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种卷曲霉素的制备方法。
【背景技术】
[0002] 结核病死灰复燃，正严重威胁人类健康。近年来，耐多药结核(MDR-TB)的出现，以 及结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒的联合感染导致结核病再度在全球成流行趋势。卷曲 霉素是治疗耐多药结核分枝杆菌和持留菌感染的一类重要药物。该药对耐药型结核杆菌感 染引起的肺结核疗效显著，毒副作用较其他二线药物小，是目前较理想的抗结核菌药物。
[0003] 卷曲霉素，是由卷曲链霉菌发酵产生的环状多肽类抗生素，由四个结构相似的活 性化合物IA、IB、IIA、IIB组成，其中IA和IB的含量占90%以上，是发挥疗效的主要成分。
[0004] 目前，国内生产硫酸卷曲霉素的主要技术手段如专利CN100471867 C，利用离子交 换树脂进行吸附、脱盐、脱色、反复中和，再经浓缩、喷雾干燥而成，过程复杂，不利于环保， 影响收率及产品质量。
[0005] 如何能够提高卷曲霉素产率及质量，发明人做了大量实验研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种工艺流程短、易操作、产品纯度高、有利环保的卷曲霉素 的制备方法。
[0007] 本发明提供的一种卷曲霉素的制备方法，包括以下步骤： a、将超顺磁性微球加入卷曲霉素发酵液中，搅拌使之吸附完全，然后分离出超顺磁性 微球。
[0008] b、将分离出的超顺磁性微球先用水净化，再用酸性水溶液洗脱，得到卷曲霉素洗 脱液。
[0009] c、将卷曲霉素洗脱液中加入活性炭脱色，过滤，得到卷曲霉素脱色液。
[001 0] d、卷曲霉素脱色液经纳滤、喷雾干燥，得到卷曲霉素产品。
[0011]其中步骤(a)所述超顺磁性微球的粒径为10_30μπι，表面的功能基团为经氢氧化钠 溶液处理后的钠型结构。所述超顺磁性微球的加入量为每升发酵液加入30-60克。
[0012]其中步骤(b)所述酸水0.2-0.5mo VL的硫酸水溶液。用量为每克超顺磁性微球加 入4_6_升。
[0013] 其中步骤(C)所述活性炭用量为每升洗脱液加入0.5-1.0克，脱色时间30-40min。
[0014] 步骤(d)所述纳滤所用的过滤膜为截留分子量100_300Da的卷式膜。
[0015]步骤(d)所述喷雾干燥的料液浓度为25-30万yg/mL。
[0016] 超顺磁性微球的预处理及再生，在使用前用2-5倍(v/w)的2m〇L/L的NaOH水溶液， 静态浸泡2-4小时后过滤，然后用去离子水洗涤至pH值至为7-8，备用。
[0017] 本发明具有如下优点：1、采用超顺磁性微球，在提取过程中无需对发酵液进行预 处理及预热，既能够实现目标物的简便分离，生产周期为由56h缩减为18h，效率提高2/3,废 液排放减少1/2; 2、超顺磁性微球选择性高，无需昂贵的提取分离设备即可得到高纯度的 卷曲霉素产品，产品质量优于药典标准，收率大于85%，收率较原工艺提高10%;3、整个提取 过程未使用有机溶剂，节能环保;4、超顺磁性微球具有可回收、反复利用、再生简便等优点； 5、本发明所述方法工艺流程短，克服了卷曲霉素难于纯化的缺点，且具有易操作、可控性强 的优点，为工业化生产提供有力的技术支撑。
【附图说明】
[0018] 图1卷曲霉素产品高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0019] 下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发 明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0020] 本发明所使用的卷曲霉素发酵液，为华北制药集团新药研究开发有限责任公司生 产。超顺磁性微球，苏州纳微生物科技有限公司；喷雾干燥机(SP-1500)，上海顺仪实验设备 有限公司；高效液相色谱仪(SH)-M20A型紫外检测器，LC-20AT栗，SIL-20A自动进样器，CTO-IOAS柱温箱，岛津公司）;蒸馏水，为本实验室自制;其他试剂为分析纯。
[0021 ]卷曲霉素发酵液的制备 将卷曲链霉菌菌株(编号NRRL2773)的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28°C、 220 rpm、培养60h获得种子液;将种子液接种到发酵罐进行发酵培养，接种量为10%，培养温 度29°C、罐压0.05±0.01 Mpa、通气比为I: 0.8vvm，400 rpm搅拌，在发酵培养开始40小时 后每升发酵液加入1.5g赖氨酸，总发酵144 h。
[0022] 其中所述的种子培养基按以下方法制得：蔗糖30.0克、酵母粉8.0克、硫酸铵2.0 克、玉米浆5.0克、氯化钠1.0克、碳酸钙5.0克，加自来水定容至1000mL，pH7.0，121°C灭菌 30min〇
[0023] 其中所述的发酵培养基按以下方法制得:玉米淀粉30.0克、棉籽蛋白粉20.0克、酵 母粉5.0克、硫酸铵2.0克、玉米浆6.0克、磷酸二氢钾2.0克、氯化钠2.0克、碳酸钙5.0克，加 自来水定容至1000mL，pH7 · 0，121°C灭菌30min。
[0024] 超顺磁性微球的预处理及再生 超顺磁性微球的预处理及再生，在使用前用2-5倍(v/w)的2m〇L/L的NaOH水溶液，静态 浸泡2-4小时后过滤，然后用去离子水洗涤至pH值至为7-8，备用。
[0025] 实施例1 300mL发酵液，发酵单位11530yg/mL，加入粒径为ΙΟμπι的超顺磁性微球18g，搅拌吸附Ih 后，分离超顺磁性微球，用36mL水洗涤分离出的超顺磁性微球，然后用108mL 0.2mol/L的硫 酸水溶液洗脱超顺磁性微球，收集卷曲霉素洗脱液，洗脱液加入〇. 054克的活性炭脱色，室 温搅拌30min后过滤，滤液再经IOODa卷式膜纳滤至溶液浓度25万yg/mL，进行喷雾干燥，得 到卷曲霉素产品（高效液相色谱图见图I )3. Og，含量98.6%，收率85.5%。
[0026] 实施例2 IL发酵液，发酵单位11583yg/mL，加入粒径为20μηι的超顺磁性微球50g，搅拌吸附1.5h 后，分离超顺磁性微球，用IOOmL水洗涤分离出的超顺磁性微球，然后用200mL 0.3mol/L的 硫酸水溶液洗脱超顺磁性微球，收集卷曲霉素洗脱液，洗脱液加入ο. 16克的活性炭，室温搅 拌40min后过滤，滤液再经200Da卷式膜纳滤至溶液浓度28万yg/mL，进行喷雾干燥，得到卷 曲霉素产品I 〇. I g，含量98.9%，收率86.2%。
[0027] 实施例3 3L发酵液，发酵单位11516yg/mL，加入粒径30μηι的超顺磁性微球90g，搅拌吸附2h后，分 离超顺磁性微球，用180mL水洗涤分离出的超顺磁性微球，然后用450mL 0.5mol/L的硫酸水 溶液洗脱超顺磁性微球，收集卷曲霉素洗脱液，洗脱液加入0.45克的活性炭，搅拌35min后 过滤，滤液再经300Da卷式膜纳滤至溶液浓度30万yg/mL，进行喷雾干燥，得到卷曲霉素产品 30 · 3g，含量 98 · 7%，收率 86 · 6%。
[0028] 对比例1 300mL发酵液，发酵单位11530μ8/ιΛ，加入300mL水稀释后，用草酸调PH=3.0，然后加入 3〇g珍珠岩助滤剂，搅拌30min后过滤，滤液用2mol/L的NaOH溶液调PH=7.0,然后导入IOOmL 径高比为1:10的离子交换树脂D1161进行吸附，吸附完毕，饱和树脂用300mL去离子水净化 后，用300mL的lmol/L的硫酸水溶液洗脱，洗脱液导入30mL径高比为1:5离子交换树脂I X 16 脱盐，脱盐液中加入适量离子交换树脂33 Γ1311，搅拌将洗脱液中和至PH=6.0,中和液导入 50mL径高比为1:10的离子交换树脂122^ 1脱色，脱色完毕，饱和树脂分别用150mL0.5、1.0、 1.5mol/L的硫酸水溶液梯度洗脱，洗脱液中加入适量离子交换树脂331 411,搅拌将洗脱液中 和至PH=7.0,即得到精制液，精制液浓缩至25万yg/mL，进行喷雾干燥，得到卷曲霉素产品 2 · 8g，含量 95 · 6%，收率 77 · 4%。
[0029] 对比例2 IL发酵液，发酵单位11583此/11^，加入IL水稀释后，用草酸调PH=3.5，然后加入160g助 滤剂搅拌30min后过滤，滤液用2mol/L的NaOH溶液调PH=7.5，然后导入300mL径高比为1:10 的离子交换树脂Dlie^ la进行吸附，吸附完毕，饱和树脂用1000 mL去离子水净化后，用700mL 的2mol/L硫酸水溶液洗脱，洗脱液导入IOOmL径高比为1:10离子交换树脂I X 16脱盐，脱盐 液中加入适量离子交换树脂33厂'搅拌将洗脱液中和至PH=7.0,中和液导入150mL径高比 为1:10的离子交换树脂122_h脱色，脱色完毕，饱和树脂用分别用450mL0.5、1.0、1.5mol/U9 硫酸水溶液梯度洗脱，洗脱液中加入适量离子交换树脂331 411，搅拌将洗脱液中和至PH= 6.5，即得到精制液，精制液浓缩至30万yg/mL，进行喷雾干燥，得到卷曲霉素产品9.2g，含量 96.2%，收率 76.4%。
[0030] 对比例3 3L发酵液，发酵单位11516μ8/ιΛ，加入3L水稀释后，用草酸调PH=3.2，然后加入600g助 滤剂搅拌30min后过滤，滤液用2mol/L的NaOH溶液调PH=8.0，然后导入IL径高比为1:10的离 子交换树脂Dl 16^进行吸附，吸附完毕，饱和树脂用3L去离子水净化后，用2.5L的1.5mol/L 硫酸水溶液洗脱，洗脱液导入300mL径高比为1:10离子交换树脂I X 16脱盐，脱盐液中加入 适量离子交换树脂33厂'搅拌将洗脱液中和至PH=6.5,中和液导入500mL径高比为1:10的 离子交换树脂1224脱色，脱色完毕，饱和树脂用分别用1500mL 0.5、1.0、1.5mol/L的硫酸水 溶液梯度洗脱，洗脱液中加入适量离子交换树脂33Γ1311，搅拌将洗脱液中和至PH=7.0，即得 到精制液，精制液浓缩至30万yg/mL，进行喷雾干燥，得到卷曲霉素产品27.7g，含量95.8%， 收率76.8%。
【主权项】
1. 一种卷曲霉素的制备方法，包括下述步骤： a、 将超顺磁性微球加入卷曲霉素发酵液中，搅拌使之吸附完全，然后分离出超顺磁性 微球； b、 将分离出的超顺磁性微球先用水净化，再用酸性水溶液洗脱，得到卷曲霉素洗脱液； c、 将卷曲霉素洗脱液中加入活性炭脱色，过滤，得到卷曲霉素脱色液； d、 卷曲霉素脱色液经纳滤、喷雾干燥，得到卷曲霉素产品。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(a)所述超顺磁性微球的粒径为10-30μπι， 表面的功能基团为经氢氧化钠溶液处理后的钠型结构。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(a)所述超顺磁性微球的加入量为每升发 酵液加入30-60克。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)所述酸水为0.2-0.5mol/L的硫酸水溶 液。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)所述酸水用量为每克超顺磁性微球加 入4_6_升。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤（c)所述活性炭用量为每升洗脱液加入 0.5-1.0 克。7. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(d)所述纳滤所用的过滤膜为截留分子量 100-300Da的卷式膜。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(d)所述喷雾干燥的料液浓度为25-30万μ g/mL〇
【专利摘要】本发明公开了一种卷曲霉素的制备方法，该方法包括以下步骤：将超顺磁性微球加入卷曲霉素发酵液进行吸附、洗脱、脱色、喷雾干燥等，得到卷曲霉素产品。本发明在提取过程中无需对发酵液进行预处理及预热，无需昂贵的提取分离设备，生产周期缩短2/3，污染减少1/2，收率提高10%，为工业化生产提供技术支撑。
【IPC分类】C07K1/14, C07K7/56
【公开号】CN105504023
【申请号】CN201610097986
【发明人】高任龙, 王海燕, 张雪霞, 任风芝, 耿文飞, 段宝玲
【申请人】华北制药集团新药研究开发有限责任公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月23日