一种曼西醇类化合物的提取分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然药物化学领域，特别是一种曼西醇类化合物的提取分离方法。
【背景技术】
[0002] 大戟属植物作为一种具有悠久用药历史的传统药物，其用药经验在世界各地均有 报道，在我国《中药大辞典》和《中草药汇编》（1987年版)分别记载有32种和35种入药。大戟 属药用植物常用作通便、利尿药物，用于治疗水肿、结核、牛皮癣、疥疮、无名肿毒等疾患。研 究表明，大戟属植物化学成分十分复杂，主要含有二萜酯类，三萜类、留醇类、黄酮类和酚性 成分。该属植物所具有的多种活性，如抗肿瘤、抗病毒、皮肤刺激以及致癌活性等，引起了广 泛的学术关注。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种曼西醇类化合物的提取分离方法，为研究大戟属药用 植物的药用价值提供参考。
[0004] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种曼西醇类化合物的 提取分离方法，提取分离方法包括了：
[0005] (1)蒿状大戟样品粉碎后以浓度为70%的丙酮-水浸泡提取，提取液减压浓缩除去 丙酮；
[0006] (2)浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩得浸膏；
[0007] (3)石油醚浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用中压和高效液相色谱法进一步分离， 即得到所需的化合物；
[0008] 曼西醇类化合物的提取分离详细步骤为：
[0009] (1)以蒿状大戟地上部分粉碎至20-40目，以浓度为70%的丙酮-水为溶剂，室温浸 泡提取3次，每次2天，合并提取液，减压浓缩去除丙酮；
[0010] (2)浓缩液依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶剂得浸 膏；
[0011] (3)石油醚浸膏用60-100目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，用体积配比为 1:0-1:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液并浓缩;洗脱液的4:1组分 经中压液相色谱MPLC(MCI gel CHP 20P，90%甲醇）得组分Fr.A，Fr.A再经凝胶色谱 Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脱，后经半制备高效液相色谱法分离纯化即得到所需的 化合物。
[0012] 其中，石油醚-丙酮梯度洗脱溶液体积配比分别为1:0、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1。 [0013]优选的，高效液相色谱法分离纯化是采用l〇mm X 250mm的C18色谱柱，流速为 3.6mL/min，流动相为72 %的甲醇，保留时间tR = 30.3分钟。
[0014] 本发明具有以下有益效果：
[0015] 1.本发明通过严谨的科学提取分离纯化工艺，得到的化合物经过多种结构表征， 可以确认为14-去羰基_2α，3β，5α，7β，10-五乙酰氧基-14α-苯甲酰基-15β-烟酰基-10，18- 二氢曼西醇。
[0016] 2.分离得到的化合物细胞毒活性实验表明，该化合物对人白血病细胞(HL-60)和 人肝癌细胞(SMMC-7721)具有较好的细胞毒活性，IC5Q值分别为3.80μΜ和4.33μΜ，对于其它 测定的细胞株也显示出一定的细胞毒活性，为后续应用开发奠定了科学依据。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明的化合物结构示意图。
[0018] 图2为本发明的化合物高分辨质谱。
[0019] 图3为本发明的化合物1H NMR谱图。
[0020] 图4为本发明的化合物13C NMR谱图。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。
[0022] 实施例1
[0023]本发明公开了一种曼西醇类化合物的提取分离方法，包括：
[0024] (1)以蒿状大戟地上部分粉碎至20-40目，以浓度为70%的丙酮-水为溶剂，室温浸 泡提取3次，每次2天，合并提取液，减压浓缩去除丙酮；
[0025] (2)浓缩液依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶剂得浸 膏；
[0026] (3)石油醚浸膏用60-100目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，分别用体积配 比为1:0、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液 并浓缩;洗脱液的4:1组分经中压液相色谱MPLC(MCI gel CHP 20P，90%甲醇)得组分Fr.A， Fr.A再经凝胶色谱Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脱，后经半制备高效液相色谱法分离 纯化，采用1 〇mm X 250mm的C18色谱柱，流速为3.6mL/min，流动相为72 %的甲醇，保留时间tR =30.3分钟即得到所需的化合物。
[0027] 实施例2
[0028]实验目的及方法:对所提取的化合物进行表征，表征内容如下：旋光度、紫外光谱 (甲醇溶剂）、红外光谱(溴化钾压片）、高分辨质谱、1D和2D核磁共振谱，所采用表征方法均 按照标准操作，无任何修改。
[0029]实验结果：
[0030]旋光[€1]23.20-119.5(。0.18，甲醇），紫外（甲醇）人臆（1叩8):224(3.55)和201 (3.47)nm，高分辨质谱HR-ESI-MS m/z 842.2994[M+Na] +，计算值，842.3000，揭示分子式为 C43H49NO15,红外光谱IR(KBr压片）：3441，1740,1631，1371，1243cm-VH NMR谱显示（表1)9个 甲基单峰δΗ 2·31，2· 13，1 ·99，1 ·80，1 ·76，1 ·65，1 ·56，1 ·37和 1 ·26，其中5个为乙酰基所有， 4个连在季碳上。同时咕NMR谱还显示了 1个单取代苯RH8.11(2H，d，J = 7.4Hz)，7.60(lH，t， 了 = 7.4他），7.47(2!1，^ = 7.4抱）]和1个单取代啦啶[5[19.24(1!1，8)，8.80(1!1，1^8)，8.32 (lH，d, J = 7.4Hz)，7.46(lH，overlapped)]。此外，还观察到2个邻位稀碳质子[δΗ6· 17(1H, m)，5.92(lH，dd，J= 10.0,5 ·7Ηζ)]和1个氧化亚甲基[δΗ4·20(1Η,d，J = 8.8Hz)，3·55(1Η， dd，J = 8 · 8，1 · 4Hz) ]。13(：匪R谱显示有7个羰基信号^170 · 8，170 · 5，169 · 6，169 · 5，168 · 7， 165.9和164.9。因此，化合物1可能是1个高度氧化的四环二萜，具有5个乙酰氧基，1个苯甲 酰基和1个烟酰基。比较化合物1和已知化合物euphorprolitherin B(分离自Euphorbia p r ο 1 i f e r a的曼西醇）的N M R谱数据发现，它们结构非常相似，不同处在于 euphorprolither in B中C-3位的丙酰氧基和C-15的乙酰氧基分别被化合物1中的1个乙酰 氧基和1个烟酰氧基所取代。HMBC谱中观察到的甲基δ Η2.31(3Η，8)和氧化次甲基信号δΗ5.66 (1!1，(1，1 = 3.7他，!1-3)与酯羰基心168.7的相关确认了上述推断。同理，其它取代基的位置 也根据2D NMR谱(4-? C0SY，HSQC和HMBC)进行了指认(见图1)。
[0031 ]化合物1的相对构型由R0ESY谱（图1)结合其生源途径加以确认。文献报道的天然 产物曼西醇二萜，其5/7/6稠合形成的三环为反式稠合，且H-4和H2-17为α-取向，16位甲基， H-12，C-11侧链和C-15酰氧基均为β-取向[2]。此外，在R0ESY谱中可观察到Η-4α与Η-3，Η-7 与Η 2-17的相关，揭示Η-3和Η-7为α-取向，观察到的Η-12β与Η-5，Η-12与Η-14，Η-18与20位甲 基的相关说明Η-5，Η_14和20为甲基为β-取向。最终，化合物1确定为：14_去羰基_2α，3β，5α， 7β，10-五乙酰氧基-14α-苯甲酰基-15β_烟酰基-10,18-二氢曼西醇。
[0032]表1.化合物的1Η(600ΜΗζ)和 13C(150MHz)NMR 数据(CDChJppm)
[0035] 实施例3
[0036] 实验目的及方法:评估提取分离得到的化合物的细胞毒性和细胞增殖情况影响， 分别采用MTT法和SRB法进行分析评估，分别对人白血病细胞(HL-60)、人肝癌细胞（SMMC-7721)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人结肠癌细胞（SW480)进行细胞毒实 验，具体实验方法为参照标准实验方法进行，无其他修改。
[0037] 实验结果：
[0038] 化合物对人白血病细胞（HL-60)的IC5〇值为3.80μΜ、人肝癌细胞（SMMC-7721)的 IC50值为4.33μΜ、人肺癌细胞(Α549)的IC5Q值为10.27μΜ、人乳腺癌细胞(MCF-7)的IC 5Q值为 14.67μΜ、人结肠癌细胞(SW480)的IC5Q值为10.96μΜ。化合物对人白血病细胞(HL-60)和人肝 癌细胞(SMMC-7721)有较好的细胞毒活性，对其它测试细胞也有一定活性。
[0039]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种曼西醇类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述的提取分离方法包括了： (1) 蒿状大戟样品粉碎后以浓度为70%的丙酮-水浸泡提取，提取液减压浓缩除去丙 酮； (2) 浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩得浸膏； (3) 石油醚浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用中压和高效液相色谱法进一步分离，即得 到所需的化合物； 所述的曼西醇类化合物的提取分离详细步骤为： (1) 以蒿状大戟地上部分粉碎至20-40目，以浓度为70%的丙酮-水为溶剂，室温浸泡提 取3次，每次2天，合并提取液，减压浓缩去除丙酮； (2) 浓缩液依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，去除溶剂得浸膏； (3) 石油醚浸膏用60-100目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，用体积配比为1:0-?: 1 的石油醚-丙酮溶液进行梯度洗脱 ，收集各个部分洗脱液并浓缩; 洗脱液的4:1 组分经中 压液相色谱MPLC(MCIgelCHP20Ρ，90%甲醇）得组分Fr.A，Fr.A再经凝胶色谱Sephadex LH-20,氯仿-甲醇1:1洗脱，后经半制备高效液相色谱法分离纯化即得到所需的化合物。2. 如权利要求1所述的一种曼西醇类化合物的提取分离方法，其特征在于:所述的石油 醚-丙酮梯度洗脱溶液体积配比分别为1: 〇、20:1、9:1、4:1、2:1、1:1。3. 如权利要求1或2所述的一种曼西醇类化合物的提取分离方法，其特征在于:所述的 高效液相色谱法分离纯化是采用l〇mmX250mm的C18色谱柱，流速为3.6mL/min，流动相为 7 2 %的甲醇，保留时间tR = 3 0.3分钟。
【专利摘要】本发明涉及天然药物化学领域，公开了一种曼西醇类化合物的提取分离方法，通过严谨科学的提取分离纯化工艺，从蒿状大戟中分离得到；化合物经过多种结构表征，确认为14-去羰基-2α,3β,5α,7β,10-五乙酰氧基-14α-苯甲酰基-15β-烟酰基-10,18-二氢曼西醇；分离得到的化合物细胞毒活性实验表明，该化合物对人白血病细胞(HL-60)和人肝癌细胞(SMMC-7721)具有较好的细胞毒活性，IC50值分别为3.80μM和4.33μM，对于其它测定的细胞株也显示出一定的细胞毒活性。为后续开发应用奠定了科学依据。
【IPC分类】C07D405/12, A61P35/02
【公开号】CN105481840
【申请号】CN201510881868
【发明人】赵勇, 王莉, 迟宇前, 赵炎, 臧贞
【申请人】云南师范大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月7日