用于控制多肽的α-酰胺化和/或C-末端氨基酸分裂的细胞培养基和方法
【技术领域】
[0001] 本发明广泛地涉及细胞培养基组合物和细胞培养方法的技术领域。特别地，本发 明是针对降低多肽，如糖蛋白的异质性。
【背景技术】
[0002] 在哺乳动物细胞的重组蛋白的生产过程中，蛋白质的多个修饰是发生在表达后 (即翻译后），且因此导致重组蛋白产物的异质性。由于翻译后修饰并不是由蛋白质核苷酸 序列编码进行编码，而是主要依赖于几个环境酶的作用，从而在生产过程中它们是难以控 制并保持在严格(期望）的规格范围。因此特别是在重组治疗性蛋白的制造过程中，最大的 挑战是保持蛋白质产物恒定的特性和质量。
[0003] 在多肽的所有相关可能质量属性的综合列表内，C-末端α-酰胺化是归因于C-末端 异质性的基团。重链上的C-末端赖氨酸(Lys)的处理是重组单克隆抗体(mAb)最常见的修饰 之一。重链的C-末端Lys可以通过碱性羧肽酶（CP)的活性被完全地或部分地除去。通过 128Da除去一个C-末端Lys残基降低了分子量，并通过1个单位增加了正电荷。部分地除去C-末端Lys残基导致（由于单克隆抗体(mAb)的四级结构)抗体的混合种群具有零个，一个或两 个C-末端赖氨酸残基(Liu等人，2008)。在缺乏赖氨酸时，能够进一步去除第二氨基酸甘氨 酸(Gly)，随后剩余的C-末端氨基酸脯氨酸(Pro)酶促地α-酰胺化。
[0004] C-末端α-酰胺化是公知的，并在多肽和蛋白质的生物活性中具有重大意义。许多 神经肽需要C-末端α-酰胺化步骤以使其成熟为活性的受体结合分子。例如，神经毒素非酰 胺化类似物较包括C-末端α-酰胺化脯氨酸(Pro)的神经毒素具有四倍较低活性。在人血浆 中人免疫原性MART-I肽的稳定性因 C-末端α-酰胺化显著增加。蛇毒C-末端α-酰胺化通过降 低其蛋白质降解来增加其在溶液中的寿命，并导致与未修饰的肽相比，其具有更高的活性。 四肽乙酰基-丝氨酸（Ser)-天冬氨酸(Asp)-赖氨酸(Lys)-脯氨酸(Pro)抑制人类和鼠原始 造血细胞的增殖，且很容易通过血管紧张素 I-转换酶(ACE)降解。其C-末端α-酰胺化类似物 不能因 ACE而降解，且其血浆水平比野生型肽高26倍。因此多肽的C-末端α-酰胺化增加了其 固有的生物学和免疫学活性，以及稳定性。
[0005] C-末端α-酰胺化是专有的酶反应，由双功能肽酰甘氨酸α-酰胺化(PAM)酶催化。第 一个步骤是:通过肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM，EC 1.14.14.3)域进行C-末端甘氨酸 残基的α-羟基化。第二个步骤是：通过肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化分裂酶（PAL，EC 4.3.2.5)域(Metha NM，2009)使α-羟基甘氨酸延长肽进行脱烷基化形成α-酰胺化肽和乙醛 酸盐。进一步地，参见国际申请PCT/EP2011/069756或PCT/EP2013/057866，可以获悉PAM的 酶促反应，该申请的全部公开内容在此引入本文。
[0006] 在此背景下，实施了纯化PAM酶的多项研究以增加体外和体内的C-末端α-酰胺化。 在这些研究中，揭示了多种不同的活化剂，抑制剂和辅因子。
[0007] ΕΡ0409294Α1描述了一种充当PAM酶的辅因子的物质，其在高于225nm时没有吸收 光谱，且不是肽，也不是茚三酮阳性物质，其具有小于I，〇〇〇Da的分子量，在电渗析迀移到正 极并具有两亲性结构。前述的抑制剂被用于多肽或蛋白质的C-末端α-酰胺化的制备 (Gunther K,1990)〇
[0008]另一个用于C-末端α-酰胺化的辅因子在GB2233978A中有描述。PAM酶的辅因子是 具有式R-(C = 0)n-(CH0Rl)n-CH20R2的化合物，其中R代表氢原子或烷基，Rl和R2分别表示 PO3H2或SO3H基团（Gozzini等人，1991)。
[0009 ] 在Bradbury和其同事的论文中提出在体内使用PAM抑制剂4-苯基-3-丁稀酸。体内 抑制剂的使用可以允许控制某些肽类激素的C-末端α-酰胺化，从而导致活性形式循环水平 的降低。另外，在体内控制C-末端α-酰胺化的能力有利于促进细胞内的位置、α-酰胺化酶的 运输和储存的研究(Bradbury等人，1989) 〇
[0010]从C-末端-酰胺化肽文献数据获悉该C-末端的异质性可以影响重组多肽的某些性 质的提示。通过α-酰胺化肽的治疗潜力的识别引发了对C-末端-酰胺化过程的科学和商业 关注，例如降钙素，催产素和加压素。最近几年，开发了一些高效α-酰胺化反应，优先通过α-酰胺化酶，使用激素原催化酰胺化反应(Kim KH和Seong BL，2001)。在这种情况下，双功能 肽酰甘氨酸α-酰胺化酶被成功地用于在体外反应以将C-末端延伸肽转换成显示有C-末端 α-酰胺化残基的肽类激素 (Merkler DJ，1994)。一种用于将C-末端甘氨酸延长肽转换成相 应的脱-甘氨酸的肽酰胺的方法在GB 2220938 A中披露(Castiglioreet等，1990)。
[0011]然而，仍很少有人知道C-末端α-酰胺化在较大的多肽如抗体中的影响。甚至很少 或没有知识涉及重组多肽，如糖蛋白的C-末端的异质性在毒理学方面和免疫原性的影响， 但是从上述调查结果中可以实施一些外推法。如果修饰了抗体蛋白的表面或电荷，抗体固 有的抗原性可以被改变。对于抗体靶肽，Maillgreand及其同事表明，目标肽的C-末端α-酰 胺化在相应抗体特异性引发了惊人的影响。当多肽表现出C-末端α-酰胺化时，小鼠的抗体 反应急剧增加。根据这些数据，本发明的发明人假定，具有C-末端α-酰胺化的治疗性多肽， 特别是治疗性抗体，具有可以改变光敏处理(免疫原性）的潜力。根据这些C-末端α-酰胺化 增加了多肽的寿命和T细胞应答的证据(Mai Ilgreet等，1995)，该抗体的半衰期的延长也可 能对所需的药理学功效和在单克隆抗体本身的潜在免疫应答产生相当大的影响。
[0012] 因此，本领域技术人员需要理解，对于重组表达的治疗性多肽(如抗体)的制备，控 制所产生的多肽在翻译后的C-末端修饰是特别重要，为提供i)恒定的产品质量和稳定的高 产量，和/或ii)增加生产过程的效率，和/或iii)，增加和/或微调所产生的多肽的生理活性 和衍生药物的安全性，和/或iv)将产生多肽的翻译后的功能与那些参考多肽匹配。
[0013] 鉴于上述情况，有必要通过提供用于调节PAM和/或CP的酶活性的装置，实现在生 产重组(glyco-)多肽期间控制或调节C-末端异质性的稳定可控的方法。此外，这队获得高 质量非免疫原性重组多肽也是有必要的。
[0014] 因此，本发明要解决的问题是提供用于控制C-末端异质性的量的装置和方法，特 别是关于(治疗性)多肽的C-末端α-酰胺化。
[0015] 通过在本发明的独立权利要求提供的实施方式解决所述技术问题。从属权利要求 中提供有关优选实施方案。但是应该理解的是，由数值限定的范围应被理解为包括所述限 定值。
【发明内容】
[0016]本发明提供了用于产生非免疫原性多肽的装置和方法，其中该装置和方法适合于 大规模生物过程。
[0017]本发明通过用于调节(例如，减少)翻译后修饰的C-末端异质性的装置和方法解决 上述问题，其基本上由表达多肽的氨基酸残基的α-酰胺化和/或C-末端分裂组成，采用了具 有确定浓度的至少一种必需的微量元素或化合物，该化合物包括在细胞培养基中作为添加 剂的元素。
[0018] 本发明基于令人惊讶的发现，即必需的微量元素能够调节重组表达多肽的C-末端 异质性。
[0019] 换句话说，本发明涉及一种细胞培养基，用于控制在细胞培养物中的表达多肽的 氨基酸残基的[α]_酰胺化和/或至少一种C-末端分裂，其中该培养基包括至少一种必需的 微量元素或包含该元素的化合物，该元素作用于/调节肽酰甘氨酸[α]_酰胺化单加氧酶 (ΡΑΜ)和/或羧肽酶(CP)的活性。
[0020] 在另一个方面，本发明提供了一种细胞培养方法，用于控制表达多肽的至少一种 氨基酸残基的α-酰胺化和/或C-末端分裂，该方法包括至少以下步骤:i)加入至少一种必需 的微量元素至细胞培养基，该细胞培养基包含表达多肽的宿主细胞;及ii)发酵并回收由宿 主细胞产生的多肽。在本发明一个优选实施例中，所述必需的微量元素选自如下一组物质 中的至少一种:锌(Zn)、硒(Se)和/或铜(Cu)。
[0021] 根据本发明，减少在氨基酸C-末端发生α-酰胺化可以通过以下方式促进实现，既 可以通过利用含有浓度为〇.175μΜ~约2.98μΜ的硒(Se)的培养基来降低的C-末端α-酰胺化 的形成，也可以通过包含浓度约为〇.2μΜ~约20μΜ的锌(Zn)的培养基来增加一个或优选为 所有表达多肽C-末端的C-末端赖氨酸残基的比例。在一个优选的实施方案中，使用包含浓 度为ΙμΜ~2.4μΜ的硒(Se)以及3μΜ~15μΜ的锌(Zn)的培养基。
[0022] 在本发明的优选实施方案中，表达为异源表达，并发生在真核细胞基表达系统中， 其中该真核细胞基系统包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细 胞，该低等真核细胞包括真菌和酵母细胞。
[0023] 根据本发明，该多肽的表达，即，本发明的方法发生在至少一种生物反应器(BR)或 培养容器中，包括摇瓶(SF)、T-烧瓶、瓶、反应袋、BRs和/或转瓶。
[0024] 在本发明的另一个方面，硒或其所对应的盐被当做用于肽酰甘氨酸[α]_酰胺化单 加氧酶(PAM)的抑制剂。
[0025] 定义
[0026] 除非另有说明，如本文中所用术语所给出的定义是由牛津生物化学与分子生物学 词典(Oxford dictionary of biochemistry and molecular biology)提供，牛津大学出 版社，2006年，印刷ISBN-13:9780198529170 当前在线版本：2008 ;eISBN:9780191727641。
[0027] 为了进一步阐述在本发明中的一般技术，从业者可以参照细胞生物学和组织培养 的标准教科书和评论来实践，参见实施例中列举的参考文献。分子和细胞生物化学的一般 方法可以在这样的标准教科书（如分子克隆）中找到：Laboratory Manual，第3版 (Sambrooket等，Harbor Laboratory 出版社2001年）；Short Protocols in Molecular Biology，第4版（Ausubel等编辑，John Wiley&Sons出版社 1999) ;Protein Methods (Bollaget等，John Wiley&Sons出版社 1996) ;Non_viral Vectors for Gene Therapy (Wagner等编辑，Academic出版社 1999); Viral Vectors(Kaplitt&Loewy编辑，Academic出 版社 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits编辑，Academic出版社 1997);及细胞 和组织培养：Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths，John Wiley& Sons 1998)。在本申请公开中提到的遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商 获得，如BioRacUStratagene，InvitrogeruSigma-Aldrich、和ClonTech公司。此外，在国际 申请PCT申请/EP2011/069756和PCT/EP2013/057866公开的内容，特别是在各自的实验部分 使用的方法，在此引入作为参考。
[0028] 如本文所用的生物分子，如在细胞培养物中表达多肽的"控制α-酰胺化"意味着调 节细胞培养物生长的条件，例如，包括但不限于，培养基、PH值、温度、和直到细胞收获的生 长时间，使得从细胞培养物获得的C-末端非α-酰胺化或α-酰胺化多肽原的量包括该细胞培 养物中产生的异源多肽全部量的所期望百分比。
[0029] 如本文所使用的生物分子，例如在细胞培养物中表达多肽的"控制氨基酸残基的 C-末端分裂"意味着调节细胞培养物生长的条件，例如，包括但不限于，培养基、pH值、温度、 和直到细胞收获的生长时间，使得从细胞培养中得到的多肽的量在它们的C-末端包括所期 望百分比的Lys(计算为在该细胞培养物中产生的异源多肽的全部量的分数）。
[0030] 表述"作用于"或"调节肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单加氧酶(PAM)和/或羧肽酶(CP)的 活性"表示必需的微量元素或包含该元素的化合物对该酶表现出的作用是可测量的，如PAM 和/或CP酶的活性或功能分别增加了和/或减少了。必需的微量元素或包括该元素的化合物 通过降低PAM酶复合物的催化速率来影响C-末端α-酰胺化过程。由此，必需的微量元素影响 或调节在PAM酶复合物本身，或影响肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)，这就是C-末端甘 氨酸残基分裂的原因，或肽基氨基乙醇酸裂合酶(PAL)，这就是实际α-酰胺化反应的原因。 核苷酸和氨基酸序列，例如，人类PAM是本领域已知的，并且可以由公共数据库中获得，例 如，由美国国家生物技术信息中心托管的互联网网页(NCBI )，其中包括美国国立卫生研究 院(NIH)的基因序列数据库，也引用了可通过PubMed中心获得相应的参考。例如，作为参考， PAM的人核苷酸序列和氨基酸序列在登录号基因 ID:5066或加入:AAA36414. IGI :189595就 可以获得。
[0031] 此外，必需的微量元素可以通过影响或调节该酶的活性影响羧肽酶（CP) (EC3.4.17.2和EC3.4.17.3)的速率。CP催化上述肽或多肽终端或倒数第二个键的水解分 裂，在发生了游离羧基的位置。人羧肽酶的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以 经由公共数据库中获得，例如，由美国国家生物技术信息中心(NCBI)主办的互联网网页，包 括美国国立卫生研究院(NIH)的基因序列数据库基因库，也引用了可通过PubMed中心获得 相应的参考。例如，作为参考，羧肽酶B(CP)的人类核苷酸和氨基酸序列可以在登录号为 NM004460和AAB496652 · 1 或加入:NP001862 · 2GI: 4607080获得。
[0032]在类似的方式中，术语"降低C-末端的α-酰胺化脯氨酸(Pro)的形成"意味着相比 参考样品α-酰胺化过程或反应将减少、抑制延迟、受控、限制或被调节，以此方式具有较少 的α_酰胺化。α-Pro-酰胺化受PAM酶复合物的影响，其基本上依赖于Pro和翻译蛋白质的R之 间的C-末端肽键的水解和氧化作用，其中R可以为一个或多个氨基酸残基，例如，甘氨酸 (Gly)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(lie)、缬氨酸(Val)、或苯丙氨酸(Phe)、或甘氨酸(Gly)-赖 氨酸(Lys)。该反应在大多数情况下是由PAM酶复合物催化(如上）。根据表达宿主和多肽表 达的条件下，翻译蛋白质在2 〇且<100%的范围携带至少一个翻译后脯氨酸(Pro)-NHd9 份额。该α-酰胺化导致蛋白质pH值的升高，因此是一个基本的变体。
[0033]在(单克隆)抗体或其衍生物，脯氨酸(Pro)a-酰胺(PA)通常是通过C-末