一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，属于发酵工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 丙酮酸(pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如:是糖 酵解的终产物;通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA;在丙酮酸羧化酶作 用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸;通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非常重要 的酮酸之一。由于丙酮酸是多种物质的合成前体，目前社会对丙酮酸的需求量日益增加，其 广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。
[0003]丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有 酒石酸法、乳酸乙酷空气氧化法、经基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酮酸 的生产正在以前的化工合成转向通过微生物发酵制备。微生物发酵法相对于化工合成有更 多的优点，如原料的转化率高，污染小，成本低等优点。
[0004]目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研 究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产 强度的丙酮酸菌株。目前对高产丙酮酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶 进行过表达和一些旁路途径进行敲出。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种通过过表达线粒体丙酮酸载体蛋白来增强丙 酮酸发酵的生产强度和产量的方法。
[0006]本发明的第一个目的是提供一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，所述方法是 在丙酮酸生产菌株中过表达线粒体丙酮酸载体蛋白。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述方法，是表达NCBI上GeneID:852800的线粒体 丙酮酸载体蛋白MPC1。
[0008]在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株是以缺失了Ura基因的光滑球拟酵母 T.glabrataCCTCCM202019为宿主表达NCBI上GeneID:852800的MPC1 而得到的。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述过表达是以酵母表达质粒pY26(购自德而宝公 司）为载体。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，所述重组 菌过表达线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌，是以缺失了Ura基因的T.glabrata CCTCCM202019为宿主、酵母表达质粒pY26为载体表达NCBI上GeneID:852800的MPC1。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建:将目的片段MPC1经过限制性内 切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，并将MPC1克隆到EcoRI/XamI双酶切消化的表达质粒 pY26中，得到重组酵母表达质粒pY26-MPCl，将重组质粒通过电击转化的方法转入到受体菌 T.glabrataCCTCCM202019(TglT)，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到线粒体丙酮 酸载体蛋白过量表达的重组菌Tglf(pY26-MPC1)。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是以酿酒酵母菌株N85基因组为模板 扩增得到的。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母表达质粒PY26为大肠杆菌-酵母之间的穿 梭载体，在大肠杆菌中选择标记为amp^而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。
[0015]本发明的第三个目的是提供一种利用所述重组菌发酵生产丙酮酸的方法，是将重 组菌活化后接种至发酵培养基，在30°C，220rpm条件下进行发酵培养。
[0016]在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基（/L):葡萄糖120g，尿素3.86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，维生素液 10ml，初始pH= 5 · 5;所 述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，FeS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g， ZnCl20.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述维生素液：生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0017]在本发明的一种实施方式中，所述接种的接种量为10%。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明方法可提高丙酮酸产量和生产强度的；相对于对照菌株(Tgir(pY26))，本 发明构建的重组菌株Tglf(pY26-MPCl)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮 酸生产强度分别提高了 24.9%、28.2%、91.9%和94.1 %的。
【具体实施方式】
[0020] 菌株和质粒：光滑球拟酵母（T.glabrataCCTCCM202019，TgU-)其为烟酸、生物 素、硫胺素、盐酸吡哆醇，尿嘧啶5种营养缺陷型菌株（即在T.glabrataCCTCCM202019的基 础上敲除了Ura基因）。酵母表达质粒pY26为大肠杆菌-酵母之间的穿梭载体，在大肠杆菌中 选择标记为amp"，而在酵母中选择标记为尿嘧啶缺陷型互补。
[0021] 细胞干重的测定:取一定量的菌悬液于10mL容量瓶中，加入2mL盐酸(2mol/L)溶解 悬液中的碳酸钙，加去离子水定容到10mL，充分混匀，用UV7500型可见光分光光度计，于 660nm处测定0D值，利用细胞干重标准曲线计算出细胞干重。
[0022]丙酮酸和葡萄糖的测定:高效液相色谱(HPLC)。仪器:Agilent1260高效液相色谱 仪（配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站），色谱条件：色谱柱:AminexHPX-87H ionexchangecolumn，流动相：5mMH2SO4,流速:0.6mL/min，柱温：40°C，进样量：10yL，紫外 检测器波长：210nm(检测丙酮酸），示差折光检测器:检测葡萄糖，样品制备：lmL发酵液于 12，000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22yL滤膜过滤后，进行高效液相色 谱分析。
[0023]培养基:种子培养基(g/L):葡萄糖30g，植物蛋白胨10g，磷酸二氢钾1.0g，七水硫 酸镁〇.5g，固体培养基添加20g琼脂。115°C灭菌15min。发酵培养基(g/L):葡萄糖120g，尿素 3 · 86g，MgS〇4 · 7H20 0 · 8g，KH2P〇42g，CH3⑶ONa3g，微量元素液（过滤除菌）10ml，维生素液 (过滤除菌）l〇ml，于115°C下灭菌ISminjOg/L的碳酸|丐(单独灭菌)被添加用来调节pH。微 量元素液：MnCl2 · 4H20 12g，FeS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2 0.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。维生素液：生物素0.004g，硫胺素0.75mg，吡哆醇 ο. 〇4g，烟酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。
[0024] 实施例1:酿酒酵母MPC1的扩增与表达质粒的构建
[0025] 以酿酒酵母基因组为模板，PCR扩增得到目的基因MPC1片段，通过琼脂糖凝胶电泳 得到约400bp的特异片段，目的基因MPC1经过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后， 浓缩纯化，将MPCUMPC2基因定向克隆到表达质粒pY26中，得到重组酵母表达质粒pY26-MPC1，将上述重组表达质粒转化到感受态细胞JM109并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上 进行扩增。
[0026]实施例2:重组菌的构建与鉴定
[0027]由于上述重组质粒上带有Ura3基因，将上述重组酵母质粒分别电击转化到受体菌T.glabrata(Ura-)(即缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCCM202019)，得到在不加尿嘧啶 的基础培养基上正常生长的重组菌TgU_(pY26-MPCl)
[0028] 实施例3:重组菌与对照菌对照发酵实验
[0029] 挑取重组菌TgU-(pY26_MPCl)和含有空质粒pY26的T.glabrata(Ura-)的单菌落于 种子培养基上活化培养18_24h，以10 %的接种量，将上述活化培养好的种子液接种到发酵 培养基中，在30°C，220rpm条件下进行发酵培养。发酵结果如表1所示，重组菌的细胞干重、 葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度相对于对照菌(TglT(pY26))分别提高了 24·9%、28·2%、91·9%和 94.1%。
[0030] 表1重组菌TgU_(pY26-MPCl)与对照菌TgU_(pY26)的发酵对比
[0031]
[0032] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种丙酮酸产量和生产强度提高的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达线粒体 丙酮酸载体蛋白MPC1。2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以缺失了Ura基因的光滑 球拟酵母T.glabrataCCTCCM202019为宿主表达NCBI上GeneID:85280(^^]MPC1。3. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述过表达是以酵母表达质粒pY26为载 体。4. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建:将目的片段MPC1经 过限制性内切酶EcoRI和XamI双酶切消化后，并将MPC1定向克隆到表达质粒ρΥ26中，得到 重组酵母表达质粒PY26-MPC1，将重组质粒通过电击转化的方法转入到尿嘧啶营养缺陷型 受体菌中，在不含尿嘧啶的培养基中进行筛选，得到线粒体丙酮酸载体蛋白过量表达的重 组菌TgU-(pY26-MPCl)。5. -种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，其特征在于，所述方法是在丙酮酸生产菌 株中过表达线粒体丙酮酸载体蛋白。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是表达NCBI上GeneID: 852800的 线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1。7. 权利要求1-4任一所述重组菌在发酵生产丙酮酸方面的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将重组菌活化后接种至发酵培 养基，在30°C，220rpm条件下进行发酵培养。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基1L中含有:葡萄糖120g，尿 素3·86g，MgS〇4·7H20 0·8g，KH2P〇42g，CH3C00Na3g，微量元素液 10ml，维生素液 10ml，初始pH = 5.5;所述微量元素液:MnCl2 · 4H20 12g，FeS〇4 · 7H20 2g，CaCl2 · 2H20 2g，CuS〇4 · 5H20 0.05g，ZnCl2〇.5g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L;所述维生素液:生物素0.004g，硫胺素 0.75mg，吡哆醇0.04g，烟酸0.8g，用2mol/L的HC1溶解后定容至1L。10. 权利要求1-4任一所述重组菌生产的丙酮酸在日化、食品、制备药物、农业领域的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种提高丙酮酸产量和生产强度的方法，属于发酵工程技术领域。本发明通过在光滑球拟酵母菌株中过表达线粒体丙酮酸载体蛋白，加强丙酮酸进入线粒体，进一步加强菌体的生长，从而提高生长偶联型产物丙酮酸的产量和生产强度，通过基因工程技术，将来源于酿酒酵母的MPC1基因过了表达于TgU-中，获得了一株高产丙酮酸的工程菌株TgU-(pY26-MPC1)，相对于对照菌株TgU-(pY26)，工程菌TgU-(pY26-MPC1)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度相对于对照菌(TgU-(pY26))分别提高了24.9％、28.2％、91.9％和94.1％。
【IPC分类】C12R1/88, C12N1/19, C12P7/40
【公开号】CN105462868
【申请号】CN201510907318
【发明人】周景文, 陈坚, 罗正山, 堵国成, 刘松, 方芳
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月10日