鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的利记博彩app
【专利说明】鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
[0001 ] 序列表
[0002] 本申请通过引用并入命名为"250_PCT1. ST25"的文件中的核苷酸序列，该文件大 小为24kb，以IBM-PC机器格式创建于2014年7月27日，与MS-Windows具有操作系统兼容性， 并随附提交。
[0003] 相关申请
[0004] 本申请要求于2013年7月31日提交的题为"SPHINGOLIPID-P OLYALKYLAMINE-0LIG0NUCLE0TIDE COMPOUNDS"的第61/860,274号美国临时申请的权益，其出于所有目的通 过引用整体并入本文。 发明领域
[0005] 本文公开了包括鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺在内的鞘脂-聚烷基胺基化合物和生成 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的方法、所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物、包含所述 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的药物组合物及其用于调苄基因表达的使用方法。所述寡 核苷酸包括三链DNA和单链及双链寡核苷酸(包括反义分子），和可用于治疗患癌受试者的 RNAi 分子例如双链 DNA(dsDNA)，包括 siRNA、siNA、miRNA、anti-mi!lSsaRNA。
[0006] 发明背景
[0007] 治疗性寡核苷酸(包括双链RNA(dsRNA))在临床上的应用由于缺乏安全有效的递 送系统而受到阻碍。已使用阳离子脂质来递送治疗性寡核苷酸，然而，其使用受限于细胞毒 性和阳离子脂质主要在肝中累积的事实。
[0008] 国际专利公开号TO 2008/104978、W0 2009/044392、W0 2011/066475、W0 2011/ 084193和WO 2011/085056公开了经化学修饰的dsRNA，其通过引用整体并入本文。
[0009] US 6,469，148中提供了用于大规模制备鞘氨醇的方法，US 7,771，711中公开了鞘 脂-聚烷基胺缀合物;二者均通过引用整体并入本文。
[0010] PCT公开号W0 2010/150004涉及携带脂质分子的寡核苷酸及其作为基因表达抑制 剂的用途。
[0011] 仍然需要具有活性且安全的dsRNA治疗剂，其表现出以下中的至少之一:与未经修 饰对应物相比增加的细胞摄取、增强的内体释放、增加的循环时间、有利的生物分布、降低 的细胞毒性和降低的免疫原性，同时保留治疗活性。
[0012] 发明概述
[0013] 本文提供了含鞘脂-聚烷基胺缀合物的寡核苷酸化合物、所述化合物的制备方法 及可用于生成所述化合物的中间体。本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物具有可用 于例如提供与未经修饰核酸分子相比以下中的至少一者的结构和修饰:增加的细胞摄取、 增强的内体释放、增加的循环时间、改进的生物分布、降低的毒性、降低的免疫原性、降低的 脱靶效应(off-target)或增加的载入RISC化合物。鞘脂-聚烷基胺有益地与单链或双链核 酸分子相连，并且可在癌症治疗中用作治疗剂。
[0014] 在一个方面，本文提供了含鞘脂-聚烷基胺缀合物的化合物，其具有通式I:
[0015]
[0016] 其中
[001 7] R1是支链或直链C7-C24烷基、烯基或多烯基；
[0018] R2、R3和R4各自独立地为氢、支链或直链聚烷基胺或其衍生物、核苷酸、寡核苷酸、 偶联部分或保护基团；
[0019] R3'是氢、CrC4烷基或保护基团；
[0020] A2、A3和A4各自独立地存在或不存在，但若存在则为c(o)、c(o)nhx、c(o)nhr 5x、c (o)r5x、c(o)r5c(o)x、r5x 或 r5oc(o)x;
[0021 ] R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链&-C20烃基链；
[0022] X存在或不存在，但若存在则为S、P、0或NH;
[0023] R2、R3或R4中的至少一者为支链或直链聚烷基胺或其衍生物;并且
[0024] R2、R3或R4中的至少一者为核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
[0025] 或者所述化合物的盐。
[0026] 在一些实施方案中，R1是C7-C24烷基、C1Q-C 2Q烷基或C1Q-C16烷基。优选地，R1是C13烷 基。
[0027] 在一些实施方案中，六2是以0)。在一些实施方案中，A4是C(0)。在一些实施方案中， R2是直链聚烷基胺或其衍生物。在一些实施方案中，R4是直链聚烷基胺或其衍生物。优选地， 所述直链聚烷基胺是亚精胺或精胺。在一些实施方案中，R 2是亚精胺。在其他实施方案中，R2 是精胺。在一些实施方案中，R4是亚精胺。在其他实施方案中，R4是精胺。
[0028] 在一些实施方案中，R3是氢，A2是C(0)，A3不存在，R2是精胺并且在本文中提供为具 有通式(la)的化合物：
[0029]
[0030] 其中
[0031 ] A4 存在或不存在，但若存在则选自由 C(0)、C(0)NHX、C(0)NHR5X、C(0)R5X、C(0)R5C (o)x，、r5x 和 r5oc(o)x 组成的组；
[0032] R3是氢或保护基团；
[0033] R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
[0034] R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链&-C20烃基链;并且
[0035] 每个R6独立地为氢或保护基团；
[0036] 或者所述化合物的盐。
[0037] 在一些实施方案中，R3是氢，A2是C(0)，A3不存在，R2是亚精胺并且在本文中提供为 具有通式(lb)的化合物：
[0038]
[0039] 其中
[0040] A4 存在或不存在，但若存在则选自由 C(0)、C(0)NHX、C(0)NHR5X、C(0)R5X、C(0)R5C (o)x、r5x 和 r5oc(o)x 组成的组；
[0041] R3是氢或保护基团；
[0042] R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
[0043] R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链&-C20烃基链;并且
[0044] 每个R6独立地为氢或保护基团；
[0045]或者所述化合物的盐。
[0046]在通式I、Ia和lb的多种实施方案中，A4是C(0)NHR5X，其中R4是核苷酸、寡核苷酸或 偶联部分。在一些这样的实施方案中，R5是C6烃基链并且X是0。
[0047]在通式I、Ia和lb的多种实施方案中，R4是偶联部分。偶联部分可选自亚磷酰胺;胺 (-NH2);羧基(-C00H)或活化羧基包括NHS酯;巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)，其还原为巯基； 羰基(-CH0);氰基(-CN)、羟基(-OH)和叠氮化物包括芳基叠氮化物。在一些实施方案中，R 5 是亚磷酰胺，例如2-氰乙基N，N，N'，N'_四异丙基亚磷酰二胺。在一些实施方案中，R4是活化 羰基，优选NHS酯。
[0048] 在通式I、Ia和lb的多种实施方案中，R4是2-氰乙基N，N，N'，N'_四异丙基亚磷酰二 胺，并且在本文中提供为具有如下所示通式(Ila)或（lib)的化合物：
[0050]其中，R3和R6各自独立地为氢或保护基团。
[0051 ] 在通式I、Ia和lb的多种实施方案中，A4是C(0)NHR5C(0)X，R4是NHS酯，R 5是C6烷基 链，X是〇，并且在本文中提供为具有通式II la或II lb的化合物：
[0052]
[0053] 其中，R3、R3'和R6各自独立地为氢或保护基团。
[0054] 在以上公开的任意通式的多种实施方案中，R4是寡核苷酸。所述寡核苷酸是单链 寡核苷酸或双链寡核苷酸，其可以被部分或完全化学修饰。
[0055] 所述单链寡核苷酸为例如选自由以下组成之组的反义分子:反义DNA、反义RNA、反 义DNA/RNA嵌合体、外显子跳跃分子、an t i -mi R、aRNA、适体、合成mRNA、IncRNA和shRNA。在一 些实施方案中，所述寡核苷酸是双链核酸(dsNA)分子。所述双链寡核苷酸为例如dsRNA，如 s iRNA、miRNA 或 miRNA 模拟物。
[0056] 在所述方法、用于使用的化合物或用途的一些实施方案中，经化学修饰的dsNA分 子包含：
[0057] a.具有5 '端和3 '端的8至49个核苷酸的有义链；
[0058] b.长度为15至49个核苷酸的反义链，并且每条链均具有5 '端和3 '端；
[0059] c.反义链的15至49个核苷酸序列与靶基因 RNA的连续序列互补；
[0060] d.有义链的8至49个核苷酸序列与反义链互补。
[0061 ]在一些实施方案中，反义链与有义链不对称，例如，有义链的长度为8至14个核苷 酸，而反义链的长度为15至23个核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链的长度各自独 立地为19至23个核苷酸。在一些实施方案中，反义链与有义链的长度相同。在一些实施方案 中，反义链和有义链的长度为19至23个核苷酸，优选19个核苷酸。在一些实施方案中，有义 链包含两组或更多组共价连接但并非通过共价键(即，有义链是"带切口"）相连的连续核苷 酸。
[0062] 在一些实施方案中，双链核酸分子是具有如下结构的双链RNA(dsRNA):
[0063] 5'（N)x-Z33(反义链）
[0064] 3'Z'-(N'）y_z"5'（有义链）
[0065]其中，N和Ν'各自为未经修饰核糖核苷酸、经修饰核糖核苷酸或非常规部分；
[0066] 其中，（Ν)χ和(Ν'）y分别为寡核苷酸，其中每个连续的Ν或Ν'通过共价键与下一Ν或 Ν'相连；
[0067] 其中，X和y各自独立地为15至49之间的整数；
[0068] 其中，z"存在或不存在，但若存在则为与有义链的5 '端共价连接的封端部分；
[0069]其中，Z和Z '各自独立地存在或不存在，但若存在则为1至5个连续核苷酸或非核苷 酸部分或在其所在链之3 '端共价连接的其组合；
[0070] 其中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与反义链的3'端、有义链的3'端或有义链的5'端中的 至少一者共价连接；
[0071] 其中，（N'）y的序列与(N)x的序列基本互补，并且其中（N)x包含与靶RNA中的连续 序列互补的反义序列；
[0072] 前提是当鞘脂-聚烷基胺缀合物与有义链的5'端相连时，z"不存在。
[0073] 在dsRNA的一些实施方案中，连接各个连续的N或Ν'的各共价键独立地选自磷酸二 醋键或憐fe^?醋键。
[0074]在dsRNA的某些实施方案中，x = y;并且X和y各自为15至49的整数，或17至40,优选 18至25。在一些实施方案中，1 = 7 = 19、20、21、22或23。优选地4 = 7 = 19或21。
[0075]在某些实施方案中，x = y=19。在一些实施方案中，X为19至25的整数，y为15至17 的整数，从而产生具有15至17个核苷酸碱基对的dsRNA。
[0076] 鞘脂-聚烷基胺缀合物优选地与有义链(Ν'）y的3'端、反义链(N)x的3'端或有义链 (Ν'）y的5'端中的至少一者共价连接;在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N)x的 3'端共价连接。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(Ν'）y的3'端共价连接。(N)x或 (Ν'）y的3'端可分别包括Z或Z'，例如鞘脂-聚烷基胺缀合物与之相连的核苷酸或非核苷酸 突出(overhang)。所述化合物还可包含与有义链的5'端共价连接的封端部分(z"）。
[0077] 在一些优选实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(Ν'）y的5'端共价连接。在这样 的化合物中，一个或多个核苷酸或非核苷酸部分或其组合与(N)x的3'端和/或(N)y的3'端 共价连接。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(Ν'）y的3'端或5'端相连时，Z存在。 在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N)x的3'端或(Ν'）y的5'端相连时，Z存在。 [0078] 在一些实施方案中，（Ν'）y的序列与(N)x的序列完全互补，（N)x的序列与靶RNA完 全互补。（N'）y的序列还可与(N)x的序列完全互补，并且(N)x的序列与靶RNA部分互补。在这 样的化合物中，例如，反义链[(N)X]的5 '端核苷酸与靶RNA错配。
[0079]在dsRNA的一些实施方案中，N和Ν'各自为未经修饰的核糖核苷酸。
[0080]在dsRNA的一些实施方案中，Ν或Ν'中的至少一者为经糖修饰的核糖核苷酸。
[00811在dsRNA的一些实施方案中，Ν或Ν'中的至少一者为选自以下的非常规部分:DNA、 LNA、镜像核苷酸、2 ' 5 '连接的核苷酸和无碱基部分。
[0082] 在一些实施方案中，（Ν'）y的序列与(Ν)χ的序列完全互补，并且(Ν)χ的序列与靶 RNA完全互补。
[0083] 在一些实施方案中，（Ν'）y的序列与(Ν)χ的序列完全互补，并且(Ν)χ的序列与靶 RNA部分互补。
[0084] 在一些实施方案中，（Ν'）y的序列与(Ν)χ的序列部分互补，并且(Ν)χ的序列与靶 RNA部分互补。
[0085] 在一些实施方案中，反义链[(Ν)χ]的5'端核苷酸与靶RNA错配。
[0086] 在本文所述任意通式的一些实施方案中，其中靶RNA是mRNA，优选人mRNA。在其他 实施方案中，靶RNA是非编码RNA，或长或短，转录自哺乳动物基因组。
[0087] 在另一个方面，本文提供了包含本文所公开化合物或所述化合物的盐及载体的组 合物。在一些优选实施方案中，所述化合物包括鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，其包括上 文公开的特征。在一些实施方案中，所述载体是药学上可接受的载体。在一些实施方案中， 所述组合物配制用于皮下、腹膜内或瘤内施用。
[0088] 在第三方面，本文提供了用于在患癌受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受 试者施用治疗量的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，从而治疗癌症。
[0089] 还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的盐或包含所述化合物 或所述化合物的盐的组合物，其用于治疗癌症。
[0090] 还提供了所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的盐用于制备用于 治疗癌症的药物的用途。
[0091 ]在又一方面，提供了用于增强治疗性寡核苷酸内体释放入细胞之细胞质的方法， 包括使所述细胞与鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸相接触，从而增强内体释放。可以使所述细胞 直接与所述化合物或与所述化合物的组合物相接触。还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化 合物，其用于增强治疗性寡核苷酸内体释放入细胞的细胞质中。
[0092]还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物用于制备用于增加治疗性寡核苷酸内 体释放入细胞之细胞质的药物的用途。
[0093]在另一方面，本文提供了鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺。所述亚磷酰胺可用于产生鞘 脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺的某些实施方案中，鞘脂是鞘氨 醇;其中聚烷基胺是精胺或亚精胺。下文中还提供了合成鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺的方法。 [0094]鞘脂-聚烷基胺缀合物与寡核苷酸的偶联可以在寡核苷酸的化学合成期间或之后 实施，从而形成鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物。鞘脂-聚烷基胺缀合物可以与寡核苷酸的 末端或与寡核苷酸中的内在位置相连。鞘脂-聚烷基胺缀合物可偶联为亚磷酰胺、H-膦酸酯 或磷酸三酯衍生物。本领域技术人员将确定合适的化合物及偶联方法。
[0095]该公开内容意在涵盖本文多种实施方案中公开的特征组合的任意和全部修改或 变化。尽管本文中对具体实施方案进行了举例说明和描述，但应理解，本发明涵盖用于实现 相同目的的这些实施方案之特征的任何安排。在阅读本文描述之后，形成未在本文具体描 述之实施方案的上述特征之组合对于本领域技术人员而言是明显的。
[0096] 附图简述
[0097]图1提供了用于生成鞘脂-精胺亚磷酰胺和鞘脂亚精胺亚磷酰胺的化学合成途径。 对该合成的描述提供于下文的实施例2中。
[0098] 图2是示出2,鞘脂聚烷基胺siRNA化合物的海肾荧光素酶活性剂量依赖性敲低而 其未缀合的对应物并非如此的图。
[0099] 图3是示出鞘脂-精胺siRNA化合物的海肾荧光素酶活性剂量依赖性敲低而其未缀 合的对应物并非如此的图。
[0100]图4是示出细胞提取物和血浆中鞘脂-精胺siRNA的有义链和反义链的稳定性的 PAGE凝胶的图。
[0101] 图5是示出血浆中鞘脂精胺siRNA化合物的水平的图。
[0102] 图6A、6B和7是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未激发免疫应答的结果的图。
[0103] 图8是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未活化补体的结果的图。
[0104]图9A和9B是示出肝和脾中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水平的图。
[0105] 图10是示出皮下施用之后LLC1肿瘤细胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水 平的图。
[0106] 图11是示出皮下施用之后LLC1肿瘤细胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水 平的图。
[0107] 图12是示出肿瘤中由鞘脂-精胺siRACl化合物进行RAClmRNA的RNAi介导的切割所 得RACE产物的PAGE凝胶图。
[0108] 图13A和13B示出未经处理和经鞘脂-精胺s iRNA处理之细胞的FACS移位。
[0109] 现在将描述的化合物、方法、材料和实施例仅为示例性，而无意于限制；与本文所 述的那些相似或等同的材料和方法可用于实施或测试本发明。本发明的其他特征和优点将 从以下详述和权利要求显而易见。
[0110] 发明详述
[0111] 本文公开了可用于生成鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的鞘脂-聚烷基胺衍生物， 所述化合物可用于调节靶基因表达，特别是用于下调靶基因表达。本文公开的化合物表现 出以下中的一个或多个:与未经修饰的双链核酸化合物相比提高的中革G (on-target)活性、 降低的脱靶活性、增加的摄入细胞伴随增加的内体释放入细胞质、提高的核酸酶稳定性(核 酸外切酶和/或核酸内切酶)和降低的免疫调节。不希望受到理论约束，鞘脂-聚烷基胺的存 在通过在核内体中产生"质子海绵效应"为体液中的寡核苷酸提供了稳定性、增加细胞摄入 并促进内体逃逸。所述分子和组合物能够下调、敲低、减弱、降低或抑制靶基因表达，并且可 用于治疗患有与其中基因表达具有不利后果之疾病或病症或和/或与这样的疾病或病症相 关的症状或有罹患这样的疾病或病症之风险的受试者。
[0112] 因此，在某些方面，提供了可用于下调基因表达的经修饰dsRNA化合物和包含所述 化合物的药物组合物。所述靶基因是哺乳动物或非哺乳动物靶基因。
[0113]
[0114] 应注意，本文中使用的单数形式包括复数形式，另有清楚说明的内容除外。当本发 明的方面或实施方案以马库什组或其他替代组的形式描述时，本领域技术人员将认识到本 发明还因而以任意单独成员或组成员之亚组的形式描述。
[0115] 本文所用术语"抑制"是指将基因的表达或所述基因之产物的活性降低至足以获 得期望的生物或生理效应的程度。抑制是完全抑制或部分抑制。
[0116] 术语"dsNA"和"ssNA"还包括saNA(短活化核酸)分子，其以转录和/或转录后水平 诱导靶基因表达。例如，活化NA可通过靶向基因启动子诱导相关基因的有效转录活化。 [0117]本文公开的dsNA分子可利用本领域技术人员已知的技术化学地或生物地合成。
[0118] "siNA抑制剂"、"dsRNA抑制剂"、"dsRNA分子"是能够将基因表达或所述基因之产 物的活性降低至足以实现期望的生物或生理效应之程度的化合物。本文所用术语"siNA抑 制剂"是指siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA中的一个或多个。抑制还可指下调，或者对于 RNAi而言沉默。dsRNA分子包括有义链和反义链，所述有义链也称为过客链，其与靶RNA具有 同源性;所述反义链也称为引导链，其与有义链完全或部分互补。
[0119] 本文所用术语靶基因的"抑制"或"基因表达的下调"意指基因表达(转录或翻译） 或多肽活性的抑制。靶RNA序列的多核苷酸序列是指靶mRNA、靶RNA或与靶mRNA或RNA优选地 具有至少70 %同一性、更优选80 %同一性、甚至更优选90 %或95 %同一性的其任意同源序 列。因此，本发明涵盖本文所述经过突变、改变或修饰的多核苷酸序列。术语"mRNA多核苷酸 序列"和"mRNA"可互换使用。
[0120] 术语"靶RNA"是指与dsNA或ssNA的至少一条链同源或互补或者与miRNA具有同源 性的RNA分子。靶RNA分子可以是mRNA (信使RNA)和IncRNA (长非编码RNA)或1 incRNA (大基因 间非编码RNA)，包括但不限于天然反义RNA(AS RNA)和eRNA(增强子RNA)以及pre-miRNA或 pro-miRNA。未经加工的mRNA、核糖体RNA和病毒RNA序列也可以是靶标。
[0121] 靶RNA通常由dsNA或ssNA调节。调节通常是指转录后下调（例如，通过RNAi或AS活 性)或上调(例如，通过anti-miR活性）。在一些实施方案中，ss-或dsNA(单链或双链核酸)可 以调节其革ERNA而不影响其水平，而非通过调节其功能(例如，阻断miRNA活性的anti-miR)。 在其他实施方案中，靶RNA是指在NA与靶标之间不存在直接序列同源性时其水平受ssNA和/ 或dsNA影响的RNA。这可发生在例如当靶RNA表达的活化在转录水平而非转录后水平实现时 的RNAa情况下。
[0122]本文所用术语"多核苷酸"和"核酸"可以互换使用，指包括脱氧核糖核酸(DNA)和 核糖核酸(RNA)在内的核苷酸序列。该术语应理解为包括由核苷酸类似物产生的RNA或DNA 类似物作为等同物。贯穿本公开，给出了 mRNA序列代表相应的基因。
[0123] "寡核苷酸"或"低聚物"是指约2至约100个核苷酸或更长的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是mRNA。所述寡核苷酸中的每个DNA或RNA 核苷酸可以独立地为天然的或合成的，和/或经修饰或未经修饰的。修饰包括糖、碱基和核 苷酸间修饰。本文所公开的寡核苷酸包括单链分子和双链分子，其调苄基因表达。寡核苷酸 包括反义分子(经RNAi或RNASEH机制切割的分子，包括DNA，RNA或DNA/RNA嵌合体）、双链RNA (dsRNA)(包括8丨卩祖、8丨嫩、!^1?祖、8&1?祖等）、抗1^1?、1^財莫拟物、核酶、适体、外显子跳跃分 子、合成mRNA等。"调苄基因表达"包括下调（例如，siRNA)基因表达或上调（例如，saRNA)基 因表达。
[0124]如本文中使用的，"接头（linker)"和"键(linkage)"是指连接一个化学部分与另 一化学部分的一个或多个原子，例如鞘脂-聚烷基胺与亚磷酰胺或鞘脂-聚烷基胺与寡核苷 酸。接头是含一个原子或例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个