Sept9基因启动子甲基化检测引物探针体系及其试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因突变的检测产品以及该产品所用到的检测引物和检测体系， 属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 大肠癌是自大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤;大肠癌根据肿瘤发生的部位可分为直 肠癌和结肠癌。全球每年新发大肠癌病人高达93万，已成为世界第三大常见恶性肿瘤。随着 我国人民生活水平提高、饮食习惯变化，中国大肠癌发病率正以4.2%的速度螺旋递增，远 超2 %的国际水平。在我国每年新发病例尚达13-16万人，在消化道肿瘤中大肠癌的发病率 仅次于胃癌;在我国目前大肠癌患病率已经高达46.8/10万。中国大肠癌发病还有一个明显 的特点：发病年龄以40-60岁之间居多，平均发病年龄为48.3岁，比西方人足足早了 10-15 年，在中国青年患者比欧美更为多见，30岁以下的大肠癌患者并不少见。大肠癌早期症状并 不明显，加上普通患者癌症筛查意识薄弱和对现有检测技术的排斥，大多数患者感到不适 去医院就诊时，已到了治愈率极低的癌症中晚期，这导致大肠癌的死亡率一直居高不下。大 肠癌如果在早期被检测出来，患者就能获得更高的治愈率，并且极大降低医疗费用。
[0003] 研究显示，在大肠癌病人的Septin9的V2区域的胞嘧啶会发生甲基化，而正常人中 不发生甲基化。研究表明通过检测Septin9基因的甲基化状态可辅助进行大肠癌及癌前病 变(包括息肉、腺瘤等)的早期诊断，并对大肠癌的治疗及预后等判断具有重要意义。
[0004] 目前，检测甲基化的方法包括：1、甲基化敏感的限制性内切酶(Methylat ion-sensitive restriction Endonuclease ，MS_RE) 法。但识别的CG序列因酶的识别位点有限 故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假阳性问题；2、甲基化特异性PCR法 (Methylation-specific PCR，MSP)，是目前较为常见的检测基因甲基化的方法。MSP法的原 理是首先用亚硫酸盐修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。但是该方法对引物设计 要求非常高，一般会因为亚硫酸盐过度的处理，使得模板很难扩增出来。MSP法目前多结合 巢式PCR法。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增。第一对PCR 引物扩增片段和普通PCR相似;第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段 的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的 好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩 增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。MSP法结合巢式PCR扩增的方法是设计针对 没有变化的模板的一组引物;针对变化了的模板的一组引物;看哪组引物能扩增出来从而 判断模板有没有变化，如果模板没变化，就表示模板被甲基化了。MSP法结合巢式PCR扩增的 方法能提高单一 MSP法的特异性，但操作时间长，且相比MSP法同样存在重亚硫酸盐处理不 完全导致的假阳性修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复 摸索找出合适的反应时间，造成整个检测过程繁琐，且不能做到定量检测，存在较高的假阳 性率;也存在亚硫酸盐处理过度，造成扩增困难的情况；3、甲基化敏感性解链曲线分析法 (MS-High Resolution Melting Curve，MS_HRM)，操作繁琐，假阳性率高，且不适于大量样 本的检测；4、荧光法(Methylight)，由于探针的局限性，一般没有合适的对照体系，假阳性 率较高；5、亚硫酸氢盐基因测序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)，是PCR联合Sanger测 序技术，结果准确，但过程繁琐，不适合大批量检测，且价格昂贵不能广泛使用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种方案简洁，灵敏度高，准确率高的SEP T9基 因启动子甲基化检测试剂盒，以及其检测引物探针和检测体系。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种SEPT9基因启动子甲基 化检测引物探针，包括用于判定基因组DNA质量的引物探针组X、用于判定甲基化转化率的 引物探针组Y和用于检测SEPT9基因启动子甲基化情况的引物探针组Z;
[0007 ] 所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a;
[0008] 所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b;
[0009] 所述引物探针组Z包括正向引物b、反向引物b和探针c;
[0010]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示；
[0011]所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0013]所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0014]所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0015] 所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0016] 所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0017] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b和探针c的 3'端设有淬灭荧光基团。
[0018] 上述各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μΜ;各探针应用于PCR反应中的终浓 度为0.2μΜ。
[0019]上述探针a、探针b和探针c的5'端设有相互区别的报告荧光基团。
[0020] 上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或 Cy3，第三种是Cy5或R0X;所述探针a和探针b的淬灭荧光基团是BHQ1;所述探针c的淬灭荧光 基团是MGB。
[0021] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述引物探针的 SEPT9基因启动子甲基化检测试剂盒。
[0022] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种SEPT9基因启动子甲基 化检测体系，包括用于判定基因组DNA质量的反应体系X、用于判定甲基化转化率的反应体 系Y和用于检测SEPT9基因启动子甲基化情况的反应体系Z;
[0023] 所述反应体系X包括正向引物a、反向引物a、探针a、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯 水；
[0024] 所述反应体系Y包括正向引物b、反向引物b和探针b、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯 水；
[0025] 所述反应体系Z包括正向引物b、反向引物b、探针c、PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和纯 水；
[0026]所述正向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0027] 所述反向引物a的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0028] 所述探针a的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0029] 所述正向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0030] 所述反向引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[00311所述探针b的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0032] 所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
[0033] 所述探针a、探针b和探针c的5'端设有报告荧光基团，所述探针a、探针b和探针c的 3'端设有淬灭荧光基团。
[0034]上述各反应体系的组分中包括十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2mM的dNTPs试剂1体 积，15mM的MgCh溶液1体积，4μΜ的正向引物0.8~1体积，4μΜ的反向引物0.8~1体积