一种基于荧光共振能量转移技术的阿尔法1d受体筛选模型的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染技术，构建了肾上腺素a1D受体拮抗剂 药物的筛选模型，用于待测样品对a1D的拮抗作用的高通量检测。
【背景技术】
[0002] ai肾上腺素受体(Ai-adrenoceptor，ai-AR)属于G蛋白偶联膜表面受体，广泛分布 于血管平滑肌、脂肪、肝、肺、子宫、心肌等机体的各种器官、组织和细胞，并介导多种生理效 应，在调节代谢和心血管、神经、消化、生殖、内分泌等系统的生理活动和病理改变等方面有 重要的作用，因而受到广泛重视。根据国际药理联合会受体命名与药物分类委员会规定，将 αι受体分为^/^仏~^种亚型。
[0003] BPH为一种常见的老年病，发病率极高，常导致患者排尿困难、残尿、尿急、尿频、血 尿、夜尿等，其主要治疗方法有手术法和药物疗法。近年来，有研究表明切除前列腺的患者 常会发生性功能障碍等副作用，寻求安全有效的药物治疗方法对治疗前列腺增生具有重要 意义。αι肾上腺素受体拮抗剂能够减轻括约肌紧张程度和前列腺增生程度从而缓解症状， 是目前公认的治疗BPH及由其引起的下尿路症状(LUTS)的首选药物。
[0004] 在中国人的前列腺组织中，a1A-AR的百分含量为30%，a1B-AR为45%，a1D-AR为 25%。目前临床上应用的αι受体拮抗剂，如哌唑嗪、多沙唑嗪等药物对αι受体亚型缺乏选择 性，由于W受体的广泛分布和重要生理功能，使用αι受体拮抗剂常会出现体位性低血压、头 晕、无力等副作用。故通过检测药物对a1D的拮抗作用来考察在治疗过程中是否产生不良反 应。
[0005]本实验通过建立肾上腺素a1D受体拮抗剂药物筛选模型，为有效控药物在治疗前列 腺增生中产生的不良反应具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种肾上腺素a1D受体拮抗剂高通量筛选模型，具有信噪比 高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0007]本发明的技术方案：
[0008] 本发明利用稳转细胞株的方法建立了一种肾上腺素a1D受体拮抗剂高通量筛选模 型。
[0009]步骤一 :a1D受体拮抗剂筛选模型的建立与优化。
[0010] 步骤二:阳性药验证模型可靠性。
[0011] 步骤三:高通量筛选模型验证。
【附图说明】：
[0012] 图1:IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。（n= 3,χ±5〇
[0013]图2:Epinephrine作用不同细胞数所产生量效曲线EC5Q的比较。（η= 3,χ±5.)
[0014] 图3:Tamsulosin拮抗CHO/alD稳转细胞产生的量效曲线。（n= 3，[±5.)
【具体实施方式】
[0015] 以下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0016] -、a1D受体拮抗剂筛选模型的建立
[0017] 1、实验材料
[0018] 〇10/<^细胞株、F12、10%FBS、400yg/mLG418、StimulationBuffer(SB)、C〇2培养 箱、384孔板、Paradigm?DetectionPlatform。
[0019] 2、实验步骤
[0020] (1)细胞培养
[0021] 1)T25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0022] 2)将贴壁细胞经EDTA消化、离心后重悬，对细胞计数。
[0023] 3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达至lj1.5X105ce11s/mL，将此细胞悬液移 入T25培养瓶中，在37°C/5 %C02环境下培养细胞。
[0024] 4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选a1D拮抗剂试验的〇10/<^细胞应是复苏后 至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用润洗细胞一次，接着用0.5mM Η)ΤΑ消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
[0025] (2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0026] 1)配制IP-one标准稀释液:P1标准溶液(试剂盒自带)逐级稀释为最终浓度的2倍。
[0027] 2)配制激动剂肾上腺素(Epinephrine)梯度稀释液：用a1D激动剂肾上腺素刺激细 胞产生IP1，根据最终拟合曲线得到的EC5Q和窗口值确定最佳细胞数(见图1、2)。
[0028] 3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP1StimulationBuffer将（1) .4)中重悬好的 细胞分别稀释为6000cellsAiL、4000cellsAiL及 2000cellsAiL。
[0029] 4)加样:a:将（2).1)中稀释好的IP1溶液加入384白板中，每孔10μ1，三个复孔;b: 将(2).2)中稀释好的肾上腺素溶液按每个浓度3个复孔，5μ1每孔加入384孔板中，接着向其 中分别加入(2). 3)配制好的不同浓度的细胞稀释液5μ1。此时标准曲线和反应孔反应体积 均为10μ1。将TopSeal-A膜贴于板面并37°C孵育lh。
[0030] 5)终止试剂：用Lysisbuffer(LB)将IPl-d2及anti-IPl稀释33倍，按1:1混匀平衡 室温后加入各孔，每孔10yL。将384孔板在500rpm下离心5s，使20yL试剂混合均匀以充分反 应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育lh。
[0031 ] 6)检测：孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? DetectionPlatform上检测。处理数据，确定最佳细胞数和激动剂肾上腺素的EC5Q和EC90。 (见图2)
[0032] (3)拮抗剂验证
[0033] 1)配制a1D诘抗剂塔索罗辛(Tamsulosin)梯度稀释液:诘抗剂塔索罗辛母液浓度为 100mM，用IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的4倍。
[0034] 2)配制含最佳细胞数的溶液:用SB将（1).4)中重悬好的细胞稀释为(2).6)中得到 的最佳细胞浓度(2000〇cells/well)。（见图2)
[0035] 3)加样:将(3).1)中稀释好的HEAThydrochloride溶液按每个浓度3个复孔，2.5μ L每孔加入384孔板中。将（3). 2)配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。将384孔板在 500rpm下离心5s，使7.5yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将 TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。
[0036] 4)将肾上腺素母液稀释成(2).6)中测定的EC9Q，每孔2.5μ1加入对应的含塔索罗辛 的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使10yL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂 蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37°C/5%C〇2下使之孵育45min。
[0037] 5)按（2).5)配制终止试剂。向每孔加入1(^1^1?1-(12/ &11衍-1?1溶液（1:1)。将384 孔板在500rpm下离心5s，使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放 于室温下继续孵育lh。
[0038] 6)孵育时间到达后，揭去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm?DetectionPlatform上检测。处理数据，确定诘抗剂的IC5Q。（见图3)
[0039] 二、数据处理
[0040] 1、根据最终拟合曲线得到的EC5Q和窗口值确定最佳细胞数。
[0041 ] 2、根据HEAThydrochloride拮抗CH0/a1D稳转细胞产生的量效曲线，确定拮抗剂的 IC50〇
[0042]实验结果
[0043]确定稳转细胞株肾上腺素1D受体拮抗剂药物筛选模型构建条件，每孔细胞数为 4000cellsAU，g卩20000cells/well时，所得到激动剂EC5q与报道值最接近且窗口值最大。 (见图1、2)通过该模型验证了激动剂肾上腺素对稳转细胞株alD受体的激动作用，其EC50为 321nM。同时验证了拮抗剂塔索罗辛对稳转细胞株alD受体的拮抗作用，其IC5Q为1.52nM。（见 图3)。
【主权项】
1. 肾上腺素a1D受体拮抗剂药物筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1 )a1D受体拮抗剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中T25中培养的细胞贴壁度要达到 80%，达到对数生长期，细胞密度为1.5X105cells/mL。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选 a1D拮抗剂试验的CHO/a1D细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验 前将其用PBS润洗细胞一次，接着用0.5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适 量SB重悬至所需细胞密度。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)配置IP-one标准稀释液、激动剂肾上 腺素（Epinephrine)梯度稀释液需按照给定浓度配置，细胞分别稀释为6000ce11s/yL、 4000cells/yUS2000cells/yL。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)加样方法:a:将配置好的IP1标准稀 释液加入384白板中，每孔10μ1，三个复孔;b:将稀释好的肾上腺素溶液按每个浓度3个复 孔，5μ1每孔加入384孔板中，接着向其中分别加入配制好的不同浓度的细胞稀释液5μ1。此 时标准曲线和反应孔反应体积均为?ομL。将TopSeal-A膜贴于板面并37°C孵育lh。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)终止试剂配置：用Lysisbuffer(LB) 将IPl-d2及anti-IPl稀释33倍，按1:1混匀平衡室温后加入各孔，每孔10yL。将384孔板在 500rpm下离心5s，使20yL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温 下继续孵育lh。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3 )配制α1D拮抗剂塔索罗辛 (Tamsulosin)梯度稀释液:诘抗剂塔索罗辛母液浓度为lOOmM，用ΙΡ1StimulationBuffer 逐级稀释为终浓度的4倍。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)加样方法:将稀释好的塔索罗辛溶液 按每个浓度3个复孔，2.5yL每孔加入384孔板中。将配制的细胞溶液按每孔5yL加入384孔板 中。将384孔板在500rpm下离心5s，使7.5yL试剂混合均匀以充分反应。为防止试剂蒸发造成 损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育30min。将肾上腺素母液稀释成 步骤(2)中测定的EC9Q，每孔2.5μ1加入对应的含HEAThydrochloride的384孔板中。将384孔 板在500rpm下离心5s，使10yL试剂混合均勾以充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将 TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37°C/5 %C〇2下使之孵育45min。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)按步骤(2)配制终止试剂。向每孔加 入10yLIPl-d2/anti-IPl溶液（1:1)。将384孔板在500rpm下离心5s，使20yL试剂混合均匀 以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育lh。10. 权利要求1-10中所述任一所述的方法在筛选肾上腺素a1D受体拮抗剂药物的应用。
【专利摘要】利用稳转细胞株技术，构建肾上腺素α1D受体拮抗剂药物的筛选模型，验证了激动剂去氧肾上腺素对稳转细胞株α1D受体的激动作用，以及拮抗剂塔索罗辛对稳转细胞株α1D受体的拮抗作用，实现待测样品对α1D的拮抗作用的高通量检测，为有效控药物在治疗前列腺增生中产生的不良反应具有重要意义。具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105420339
【申请号】CN201510828137
【发明人】严明, 霍婧婷, 俞沁玮, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月20日