一种筛选砀山酥梨适宜授粉梨品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及园艺作物授粉生物学领域/果树生产技术领域，特别涉及一种利用 SCoT分子标记确定父本树与砀山酥梨间亲缘关系，通过选择不同亲缘关系授粉树对其授粉 调控砀山酥梨果实石细胞团面积及含量，最终筛选出砀山酥梨适宜授粉树的方法。
【背景技术】
[0002] 砀山酥梨是我国主要梨出口品种之一，其种植面积大、产量高，因为其自花授粉座 果率极低，所以在生产上必须配置合适的授粉树。但由于授粉品种配置不恰当和田间管理 不科学等原因，导致砀山酥梨品质逐渐下滑，主要表现为果实大小不均匀，果肉多渣、含糖 量低且口感较差。相关研究表明，梨果实石细胞的密度、含量是影响梨果实品质的重要因素 之一，它不仅影响梨果实口感、果肉质地，还与果实含糖量及果汁含量密切相关，而且石细 胞的大小与含量主要受遗传控制，是一种数量性状遗传。
[0003] 因为梨具有花粉直感现象，所以父本授粉会直接影响梨果实性状，选择不同的梨 品种授粉，梨果实相关性状如石细胞大小及含量会有所不同，且父本梨与母本梨亲缘关系 的远近不同，子代果实性状会有一定的差异性。由此可见，授粉树的选择对梨果实品质的优 劣有着重要影响，然而，大部分地区果农都是根据生产经验选择当地固定的授粉树，往往由 于配置不当，降低了果园整体产量和经济效益，打击种植积极性。
[0004] 目标起始密码子多态性（start codon targeted polymorphism, SCoT)标记是近 年来兴起的一种新的DNA分子标记技术，具有多态性高，重复性好，引物通用性强等特点， 目前，SCoT标记在植物种质资源多样性方面有着广泛的应用，但是对于梨种质资源多样性 和亲缘关系方面研究鲜见报道。利用SCoT标记可以从分子层面更快速准确地对梨资源进 行遗传归类，从而选择与砀山酥梨不同亲缘关系的授粉树对砀山酥梨进行授粉，调控果实 石细胞团大小及含量，为筛选出恰当亲缘关系的优良授粉品种，提高梨果实品质，提供理论 和实践依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种通过分子标记筛选砀山酥梨适宜授粉梨品种的方法， 该方法可为砀山酥梨授粉品种配置、果实品质改良及品种选育提供技术指导。
[0006] 为了达到本发明目的，采用方案如下：
[0007] -种筛选砀山酥梨适宜授粉梨品种的方法，其特点在于，按如下步骤进行：
[0008] (1)提取授粉梨品种叶片的DNA ;
[0009] (2)进行SCoT-PCR反应，对反应产物电泳检测，）通过⑷电泳结果，记录清晰而 且可辨认的条带，计算遗传相似系数，进而进行聚类分析，构建授粉梨品种之间的亲缘关系 聚类图；
[0010] (3)根据SCoT分子标记聚类分析结果，选取亲缘关系远、中、近的授粉品种树给砀 山酥梨进行授粉；
[0011] (4)对每个授粉品种所结成熟果实果肉组织的石细胞团数目及面积进行显微观 察、计算；并测定石细胞含量；
[0012] (5)通过步骤（4)的分析结果，帅选出最优亲缘关系授粉梨品种。
[0013] 本发明特点还在于：
[0014] 所述步骤⑵中SCoT-PCR反应体系为：模板DNA 30mg/L，引物I. 0 μ mol/L，dNTPs 0.2mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1.0U，10XEasy Taq Buffer (含 2mmol/LMg2+)2.5yL，总体积为 25yL ;SCoT-PCR的反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性Imin ;50°C退火Imin ;72°C延伸 2min ;共35个循环；72°C延伸lOmin。
[0015] 进一步，所述引物序列如下表所示：
[0018] 进一步，所述步骤（3)中计算遗传相似系数，构建授粉梨品种之间的亲缘关系聚 类图具体步骤为：在SCoT分子标记的电泳图谱的同一迀移位置上，有条带的定为" 1"，无条 带的定为"〇"，做出〇、1原始数字矩阵，得出SCoT分子标记扩增产物的总条带数目和多态 性条带数目；使用软件NTsys 2. 10e，导入0、1数字矩阵，从而计算出遗传相似系数；使用 UPGMA构建梨材料之间的亲缘关系聚类图。
[0019] 进一步，所述步骤（4)中的成熟果实果肉组织是指切取距果皮2_处的果肉组织， 切取后迅速放入FAA固定液后置于4°C冰箱低温保存。
[0020] 进一步，所述步骤（4)中石细胞团数目及面积的显微观察、计算，其步骤为：将步 骤（4)FAA固定液中梨组织切片，置于载玻片上用0. 1%番红染色；利用生物显微镜在100X 放大倍数下观察，并采用内置314万像素高分辨率嵌入式一体化数码成像系统拍照记录， 观察并测定石细胞团的个数；并使用三点画圆工具计算出单个石细胞团面积。
[0021] 与已有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0022] 1.本发明对SCoT-PCR反应体系进行优化，使之更加利于梨DNA扩增：条带清晰， 多态性高，并利用其快速准确的从分子层面揭示不同梨品种资源间的亲缘关系，在明确亲 缘关系的基础上，选取与砀山酥梨亲缘关系远近不同的品种对砀山酥梨授粉，研究不同亲 缘关系授粉品种对砀山酥梨果实石细胞大小及含量的影响，为阐明异花授粉对石细胞发育 的调控机制，筛选出适宜亲缘关系的优良授粉品种，改善砀山酥梨果实的石细胞含量，提高 砀山酥梨果实品质，提供了理论和实践依据。
[0023] 2.本发明利用SCoT分子标记来辅助筛选适宜授粉树，可以直接确定父母本间最 佳配置亲缘关系，比传统方法针对性强，省时省力，不用进行大量品种异花授粉，无需等待 果实性状来筛选授粉树，利用叶片即可进行SCoT-PCR反应，确定父本树与母本树亲缘关 系，从中挑选最佳亲缘关系的授粉树授粉即可。
[0024] 3.测定石细胞大小的传统方法是通过不同孔径筛网过滤法测定，本发明利用麦克 奥迪公司制造的BA210生物显微镜内置314万像素高分辨率嵌入式一体化数码成像系统， 及其配套的江苏捷达图像分析系统，使用三点画圆工具计算出梨果肉切片中单个石细胞团 面积，相比传统方法更加快速、准确，而且无需提取石细胞，节省人力物力。
【附图说明】
[0025] 图1是本发明方法流程图。
[0026] 图2是PCR反应体系4种因素对梨SCoT-PCR反应的影响。
[0027] 图 2 中，M :250bp marker ;1 ~5 :模板 DNA 浓度分别为 10、20、30、40 和 50mg/L ; 6~10:引物浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.(^111〇1/1;11~15 :(1犯1^浓度分别为0.1、 0· 2、0· 3、0· 4 和 0· 5mmol/L ;16 ~20 :Taq DNA 聚合酶用量分别为 0· 25、0· 5、0· 75、L 0 和 I. 25U。
[0028] 图3是退火温度对梨SCoT-PCR反应的影响。
[0029] 图 3 中，M:DL 5000marker ;1 ~12:退火温度分别为 45. 0、45· 3、46· 0、47· 0、48· 2、 49. 4、50· 6、51· 8、53· 0、54· 0、54· 7 和 55. (TC
[0030] 图4A、4B是本发明引物SCoT56对43份梨材料的扩增图谱。
[0031 ] 图5是43份梨材料间的Jaccard相似系数。
[0032] 图6是供试43份梨种质资源SCoT分子聚类分析。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述该发明。应该理解，本实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体实施条件的实验方法，通常按照常 规条件或者按照厂商所公开的条件。
[0034] 本实验以来自安徽省砀山县果树试验站43份梨品种（表2)为材料对本发明方案 做进一步说明。
[0035] 一种利用SCoT分子标记筛选砀山酥梨适宜授粉树的方法
[0036] 1、方法
[0037] 步骤一，利用CTAB法提取43份梨材料叶片中的DNA，提取的DNA用1 %的琼脂糖 凝胶电泳，并用核酸检测仪测定其质量和浓度。将符合实验要求的DNA置于-20Γ保存备 用，43份梨材料如表1所示。
[0038] 表1供试梨材料
[0042] 步骤二，梨树SCoT-PCR反应体系的优化
[0043] 梨SCoT-PCR反应体系优化方法：以材料开花梨的DNA为模板，随机选取 SCoT3 (5 z -CAACAATGGCTACCACCG-3 z )作为扩增引物，利用单因素水平设计优化梨的 SCoT-PCR反应体系。将DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶这4种因素分别设置成5个 不同的水平（表3)，当考察某一因素的适宜浓度时，将其余的3个因素固定选择为第3个水 平，通过比较筛选出该因素的适宜浓度水平，从而组合得到梨SCoT-PCR的最适反应体系。 SCoT-PCR反应体系总体积为25 μ L，每个处理的10 X Easy Taq Buffer (含2mmol/LMg2+)用 量均为2. 5 μ L，不足的用ddH20补足。每次实验重复2次，最终确定梨SCoT-PCR的最适反 应体系。
[0044] 表2梨SCoT引物序列
[0047] 根据单因素水平实验得出的结果选出最适反应体系，对本研究所采用的退火温度 进行梯度优化。优化实验以开花梨的DNA作模板，选用梨SCoT-PCR反应体系优化时所用 引物 SCoT3,设定 12 个退火温度梯度：45· 0、45· 3、46· 0、47· 0、48· 2、49· 4、50· 6、51· 8、53· 0、 54. 0、54. 7和55. (TC，最终确定梨SCoT-PCR最适退火温度。
[0048] 表3梨SCoT-PCR反应体系各因素水平优化设计
[0050] 选择确定后的SCoT-PCR反应体系和适宜退火温度，随机选取开花梨和砀山酥梨 的DNA作为模板，对67条引物分别进行SCoT-PCR扩增，筛选扩增产物条带清晰且具有差异 性的引物用于所有供试材料的多态性检测。67个SCoT引物序列参照Collard和Mackill 设计（Plant Mole