生物反应器消耗单元的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及用于细胞培养物的生物反应器处理系统的领域。更具体地，本发明涉及生物反应器消耗单元，以改进生物反应器的操作和设置及其相关的流体供给。在整个文件中，术语“细胞培养物”应被理解为不仅包括哺乳动物的细胞培养物，而且还包括昆虫、藻类、植物和微生物的细胞培养物(发酵)和任何其它类型的细胞，以及其它生化过程或细胞过程，例如但不限于生物转化、转染、瞬时蛋白表达、无细胞的生物系统。然而，本发明也可用于其它的非生物的过程。
【背景技术】
[0002]通过对多种参数的细致控制，在生物反应器内产生细胞培养物，这些细胞培养物是由悬浮生长于溶液中的生长培养基中或悬浮颗粒的表面上的细胞组成的。这些生物反应器可以处理大量的细胞培养溶液。例如，大规模的生物反应器可能具有1-20000升、甚至高达50000升的容量。
[0003]在生物反应器中，细致地控制细胞所暴露在的环境很重要。环境的细微改变可以对细胞的生物机能和由每个细胞产生的目标产物(例如重组蛋白)的量(产物滴度)产生重大的影响。这反过来又对生产过程的经济性产生重大的影响。必须控制的参数包括细胞可使用的氧和二氧化碳(溶解的氧和C02)的浓度、pH值、温度和特定的营养素水平(例如葡萄糖浓度)。另外，物理环境也很关键，特别是包括气体分布的形式(例如气泡大小和整体气体流动)的重要组分。最后，液体与细胞的混合也很关键，其会影响反应器中的同质性并进而影响生物反应器中的细胞所暴露的局部环境变化。这些问题在非常大的生物反应器中变得重大。
[0004]在生物反应器系统中制备产品的公司所面临的主要挑战是为了生产特定产品而对生物反应器内的条件(状况)的优化。用于生产特定产品的特定细胞系(cell line，细胞株)的优化条件能够容易地对产品的产量产生数量级水平的影响，这反过来对生产的经济性有巨大的影响。解决这个问题并不简单；需要控制很多参数，并且最佳的方法可能涉及这些条件随时间的改变。然而，由于缺少可用设备以及操作的巨大成本，探寻改变一系列参数的影响是不现实的。运行一次21生物反应器的实际成本可能超过$2000。对于更大的规模，迅速增加的成本将变得负担不起。这些问题阻碍了基于用以解决多参数变化的影响的实验方法(通常称为D0E (实验设计))的现代统计学的应用，这类方法通常需要数十个生物反应器实验才能有价值。
[0005]这种工作产生价值的机会在近些年来有增加，因为监管机构采取了如下措施:如果控制参数中的这类变化的影响已预先被探知，那么一个生产运行中的改变并不必然意味着一个批次自动发生故障(IF)。在没有生物反应器的小规模的高度平行的模型的情况下，这是不可能的，但是这又是生产商保持竞争力所必需的。
[0006]所面临的另一问题是难以在研发早期选择出在搅拌式生物反应器环境中鲁棒(robust)且多产的细胞系。显然，当需要筛选多达数十乃至数百个细胞系时，已有的生物反应器系统是不实用的。
[0007]人们已试过了多种小规模方法的生物反应器(例如，摇动的多孔板和瓶)，但是这些生物反应器缺少真实再现具有培养参数的闭环控制的搅拌式通气系统中所存在的条件的能力。迄今为止，小规模的实验运行通常在1至10升容量的个体生物反应器(其容纳包含在溶液中的细胞培养物)中实施。这些实验在细致的监控控制下进行约两周的时间。在这段时期，上文所讨论的输入参数在各个生物反应器之间可以是不同的，且相应的生物反应器的内容物被监测，从而确定哪组参数能实现所希望的最佳结果。然后，可以使用这组参数来将过程的规模升级到满负荷生产规模；目的是使细胞生产或细胞活力最大化，以提高生产效率和/或增加产物滴度产量。
[0008]培养参数的控制需要考虑以下三方面:i)在给定时间内将参数保持在控制限度内所限定的设定点；ii)随时间推移该参数以受控、计划的方式改变；以及最后iii)该参数在各个生物反应器之间和在各次运行之间的一致性和可再现性。一旦实现这样的控制，则可以改变参数并确定这样的改变对生产能力的影响。
[0009]可以搅拌生物反应器内的细胞培养溶液以确保同质性。搅拌速率通过细胞的物理环境(例如剪切)对细胞的活力和生产寿命的影响而能够对培养物的生产能力产生重大影响。此外，搅拌速率会直接影响混合并因此影响从气泡输入流进入可供细胞使用的液相的气体的质量传递的效率。对于一特定培养物，必须建立搅拌速率和其潜在负面效果与良好的混合和气体转移的益处之间的平衡。在生产规模下，对反应器的能量输入也成为了重要的经济性考虑因素。
[0010]在很多已有的小规模系统中，并不搅拌生物反应器器皿的内容物，而是通过摇动来进行搅动。然而尽管这样简化了系统，使得器皿不需要单独的搅拌器，但这并不能产生生产规模条件(内容物被搅拌)下的准确模拟；摇动并不能再现通过搅拌器皿内容物所形成的剪切力。此外，摇动的器皿中的气体转移主要是通过表面通气，而不是将气泡提供到系统的基部，这样就改变了气体转移的动力性和物理环境。
[0011]如在来自相同申请人的共同待审的欧洲专利申请公开第2270129号(其描述了用于真实地再现较大规模的生物反应器内参数的微小规模的生物反应器系统)中所描述，生物反应器内的细胞培养溶液被搅拌以确保同质性。搅拌速率可通过细胞的物理环境(例如剪切)对细胞的活力和生产寿命的影响而对培养物的生产能力产生重要影响。此外，搅拌速率直接影响混合并因此影响从气泡输入流进入可供细胞使用的液相的气体的质量传递的效率。对于一特定培养物，必须建立搅拌速率和其潜在负面效果与良好的混合和气体转移的益处之间的平衡。在生产规模下，对反应器的能量输入也成为了重要的经济性考虑因素。
[0012]生物反应器内的气体控制有两个关键方面:即0)2的控制和02的控制。
[0013]生物反应器中的溶解氧水平必须保持在一设定水平，以确保对于细胞的一致的可用性，使得新陈代谢不受限制。通常的保持水平在通过气体饱和所实现的最大溶解氧水平的15%至50%之间变化。不同的使用者之间实现这种变化的方法有所不同，有些使用者更愿使用较低的输入浓度和较高的流速，另一些使用者更愿使用较高的输入浓度和较低的流速。对输入流速的控制是关键的，因为这影响其它气体(例如C02)从培养基脱离。
[0014]细胞周围的0)2的浓度会对新陈代谢产生重要影响。0)2的控制还另外用于结合培养基中碳酸氢盐基缓冲系统来控制pH值。气泡也是对细胞造成损伤的一个关键源头，且因此控制总气体流入速率是保持细胞活力的一个重要因素。
[0015]生物反应器中的pH值水平应当保持在预定范围内，该范围可以随着细胞培养物的生长而变化。这一般是通过液体培养基内的碳酸氢盐基缓冲系统与保持溶解co2的特定水平的结合来实现的。但是，当高于一定的细胞密度时，细胞产生的乳酸会破坏培养基的缓冲能力，且通过添加一定量的碱溶液来中和增大的酸度能够将pH值保持在理想的限度内。在生物反应器中添加碱被控制为包括pH感应器的反馈环路的一部分。
[0016]温度是生物反应器中的重要参数。培养哺乳动物细胞的生物反应器内使用的温度的变化幅度不大，这是因为细胞来源于能够控制体温的动物。但是，在培养期间可以利用一些小的变化，从而实现例如使细胞生物机能偏向于产生重组蛋白而非细胞增殖的新陈代谢的改变。对于微生物培养物，根据生物体的不同，工作温度可以在18_65°C之间变化，并且需要准确地控制。
[0017]通常，控制一加热器来增加或减少供给的热量。在某些系统中，培养物生长和进入搅拌的能量输入产生过量的热量，因此需要冷却和散热系统。
[0018]监测生物反应器中的各种不同参数对控制它们而言是一个关键。某些参数通过闭环感应和响应系统进行控制，而由于缺乏合适的在线监测系统，另一些参数通过采样和离线分析来进行控制。
[0019]可以将一系列营养素饲喂物(nutrient feed)分配到反应器中。通常，这些营养素饲喂物包括提供另外的氨基酸和碳源来替换细胞生长所用的氨基酸和碳源的培养基饲喂物。可以根据不同的计划将多种不同的饲喂物添加到生物反应器中，其通常包括纯碳源(例如葡萄糖)。通常，这些饲喂物是响应于生物反应器内参数水平的测量值而被添加的。
[0020]此外，反应器通常连接到酸和碱(硷)的供给，以便在其中控制细胞过程。同时，可将防沫剂的供给连接到反应器，以最小化由液体的搅拌所造成的泡沫生成。
[0021]对于操作者来说，将流体导管与相应的入口 /出口连接和脱离连接来建立多个流体通道用以向生物反应器输入气体和/或营养素和/或酸、碱以及防沫剂，这不仅耗时而且经常在手动操作方面是复杂的。
[0022]在专利文献EP 2270129中，该过程通过如下方案被改进:利用限定基站中相应的器皿的入口 /出口和相关联的流体口之间相应的导管的共用夹板，使得在单一步骤中能够实现多个流体通道的连接。但是，该方法的缺点在于，在多个实验运行之间，流体可能残存于夹板的导管中，从而产生了后续运行污染的风险，特别是对于营养素供给的情况更是如此。通过在各运行之间对导管进行冲刷和/或消毒可以克服这个问题，但是这会使该过程增加额外的步骤。
[0023]用于进行流体连接的另一系统和方法在共同待审的英国专利申请第1213506.7号中有说明，其中，通过将生物反应器消耗单元插入相关联的接纳站，自动进行连接。
[0024]此外，生物反应器系统必须保持无菌，这就要求不同的营养素饲喂物从无菌来源被供给。通常，在使用生物反应器的位置处，流体供给容器已装入了营养素(例如在层流罩内)，且所装载的流体供给容器在无菌条件下被连接到生物反应器。在层流罩的外面以无菌的方式进行这种连接的示例性的已知方式是通过使用管焊机，这些管焊机用于在无菌焊接操作中切割并热熔合两个先前未连接的热塑管。多次进行这种将多个源连接到生物反应器所需的各种不同的管线的操作会既复杂又耗时且相对昂贵。
[0025]为将流体供给储槽和相关联的泵送元件结合入生物反应器中，人们已进行了各种尝试。泵送元件通常为蠕动泵、齿轮泵、隔膜泵、活塞泵或其它流通泵。包括这些元件的示例在文件 US 2011/0130310AU US 6670169B1、JP 2010-142196A1、TO 2007/044699A1、US 2005/0186671A1 以及 DE 102004035107A1 中描述。在 US 2011/0130310A1、TO2007/044699A1和DE 102004035107中所示的系统都处于生物反应器消耗单元的背景下(即小型、一次性装置，其中所述流体供给储槽、生物反应器室和泵送元件都包含在一个单元中)，并且每个系统均具有处于供给储槽与生物反应器室之间的闭环流体流动路径，并进行再循环。为了对大规模的处理进行有用的小规模的模拟，对于诸如细胞培养物处理的许多应用而言，供给到生物反应器中的流体量的精确度是非常重要的；所需的量的小变化就将对细胞培养物中的反应的影响造成大的变化。因此，来自蠕动泵、隔膜泵和往复式活塞泵的脉动流并不理想。
[0026]总之，基于制造过程的生物反应器的开发和优化改良中存在一系列挑战，包括:i)由于设