食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物安全检验检测技术领域，具体涉及一种快速检测试纸片，更具 体地说，本发明涉及一种专门用于食品和餐饮具中快速检测金黄色葡萄球菌的定性和定量 检测的冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡 萄球菌属（Staphylococcus)，有"嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严 重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可 找到，因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的 感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由 金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占 到45%，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件日趋增多。金黄色葡萄球菌的流行病学 一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季，中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌 率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常 见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓 毒症等全身感染。
[0003] 金黄色葡萄球菌是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用 于食品卫生工作中，我国已将其纳入"国家标准"。国标方法检测金黄色葡萄球菌需要配制 新鲜培养基，操作方法繁琐，成本较高，检测时间长，达不到快速一步法检测，因此，业内一 直希望能有一种经济、简便、易行、快速、准确的方法和产品。
[0004] 纸片法是上世纪80年代发展起来的一种快速检测食品及食品接触的物体表面、 餐具、茶具中金黄色葡萄球菌污染情况的方法。目前，国内外对金黄色葡萄球菌检测研究较 多，基于分子生物学检测方法，如PCR方法、LAMP法、基于胶体金检测法、基于ELISA检测法、 特异性显色培养法等，但上述方法需要特殊的检测设备，不便于日常现场快速检测需求。申 请号为201410681446. 5的专利申请公开了一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基及其检 测试纸，但该专利申请中公开的检测试纸主要用于定性检测，无法做到定量检测，且该检测 试剂主要检测对象是食品，无法适用于餐饮具表面金黄色葡萄球菌的检测。
【发明内容】
[0005] 为了克服【背景技术】中所指出的问题及现有技术存在的已有检测产品和检测方法 的不足，本发明的第一个目的在于提供一种专用于食品和餐饮具中快速检测金黄色葡萄球 菌并可定性、定量分析的冷水凝胶试纸片。该试纸片不仅适合于多种食品中金黄色葡萄球 菌的检测，也可用于餐饮具中金黄色葡萄球菌的快速检测。且该试纸片检测方法操作简便 易行、快速准确，特异性强，敏感性高，成本低廉，便于基层单位特别是边沿地区及条件差的 基层试验室使用。另外，本发明还提供了一种上述所述冷水凝胶试纸片的制备方法与应用。
[0006] 为了实现本发明的第一个目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得 了如下技术方案：
[0007] 本发明的食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶试纸片，所述纸片 中含有混合培养基和冷水凝胶，所述混合培养基由基础培养基和显色剂组成，其中所述基 础培养基由蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、氯化纳、丙酮酸钠、氯化锂组成，所述显色剂为 5_溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二酸盐，所述冷水凝胶由聚丙烯酸钠、黄原胶、魔芋胶组成。
[0008] 进一步地，上述技术方案中每升所述混合培养基中含有蛋白胨5. 0~10. 0g、大豆 蛋白胨4. 0~6. 0g、酵母粉5. 0~10. 0g、氯化纳10. 0~15. 0g、丙酮酸钠3. 0~5. 0g、氯 化锂3. 0~5. 0g ;显色剂5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二酸盐0. 15~0. 20g。
[0009] 进一步地，上述技术方案中每升所述冷水凝胶含有聚丙稀酸钠4. 0~6.0g、黄原 胶2. 0~4. 0g和魔芋胶8. 0~10. 0g。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种上述所述金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶试 纸片的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0011] (1)载体纸片制备：将层析滤纸剪切成5cmX5cm规格，经辐照或高压灭菌，高压灭 菌后于50°C恒温真空干燥后备用；
[0012] (2)内包装袋：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成5. 2cmX5. 2cm 规格的联袋；
[0013] (3)基础培养基配制：每升混合培养基中含有蛋白胨5. 0~10. 0g、大豆蛋白胨 4. 0~6. 0g、酵母粉5. 0~10. 0g、氯化纳10. 0~15. 0g、丙酮酸钠3. 0~5. 0g、氯化锂3. 0~ 5. 0g；
[0014] (4)显色剂配制：每升混合培养基中含有显色剂5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二 酸盐0· 15~0· 20g ;
[0015] (5)混合培养基配制：将基础培养基与显色剂混合均匀，加去离子水定容至 1000mL，于115°C、高压条件下灭菌15min，调节pH至7. 2~7. 4 ;
[0016] (6)试纸片制作：将灭菌载体纸片依次放入灭菌的烧杯中，加入40°C~45°C的混 合培养基使之淹没纸片，浸泡8~10min，使混合培养基充分吸附于纸片，摆放于无菌不锈 钢丝网上，45°C恒温真空干燥，得到浸渍烘干的试纸片；
[0017] (7)冷水凝胶混合液配制：每升混合液中含有聚丙烯酸钠4. 0~6. 0g、黄原胶 2. 0~4. 0g和魔芋胶8. 0~10. 0g ;
[0018] (8)冷水凝胶试纸片制备：在步骤（6)所述浸渍烘干的试纸片表面均匀高压喷洒 步骤（7)所述冷水凝胶混合液，每隔2分钟高压喷洒一次，共高压喷洒5次，然后将其摆放 于无菌不锈钢丝网上，45°C恒温真空干燥；
[0019] (9)试纸片包装：将步骤（8)浸渍烘干的试纸片，无菌操作装入无菌的塑膜袋内， 其中5cmX5cm的纸片，每袋1张，再装入铝铀袋，封口后室温以下保存备用。
[0020] 如上所述的一种金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶纸片，其特征在于：所述试纸 片可同时适用于食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌的定量、定性检测。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0022] 1、本发明适用于食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌定量和定性检测分析，本发明利 用冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分和显色剂混合，均匀的负载到层析滤纸上，真 空干燥后向试纸片表面高压喷洒冷水凝胶混合液，制得冷水凝胶试纸片，在其表面形成鲜 明的菌落特征，使金黄色葡萄球菌的检测达到快速准确定量，可以用于金黄色葡萄球菌菌 落的计数，用于定量分析；
[0023] 2、本发明适用于食品和餐饮具中金黄色葡萄球菌快速检测，目前现有技术只有适 用于食品或餐饮具的金黄色葡萄球菌快速检测试纸，没有同时适合食品和餐饮具的金黄色 葡萄球菌快速检测试纸，且本发明制得的试纸片产品的敏感性高、特异性强、结果准确；
[0024] 3、本发明成本低廉，操作方法简便，检测时间只需24~36h，比国标方法缩短了 2~3天，简化到一步法即可完成，一般人员都能掌握操作；
[0025] 4、本发明采用的显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底 物反应显色的原理来检测微生物的新型培养基，利用显色培养基进行微生物的筛选分离， 其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基，本发明以5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二 酸盐作为显色剂，其化学稳定性更强，耐辐照，测试片在常温下保质期为1年时间，而现有 技术中采用的传统的显色剂，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-吡喃半乳糖苷等一般需 要在4°C条件下保存，常温保存化学性质不稳定；
[0026] 5、本发明无需利用助显色剂就可以实现显色反应，是因为冷水凝胶成分有利于菌 落的成长，不需要添加助显色剂，菌落本生就可以利用显色底物；
[0027] 6、本发明以魔芋胶作为冷水凝胶重要组成部分，其优点明显，魔芋胶具有亲水性、 稳定性、凝胶性和成膜性等优点，特别是成膜性的特点使其容易在纸片表面形成一层薄膜， 但是由于金黄色葡萄球菌一般需要在冷水凝胶层较厚的纸片上才能形成清晰的菌落，而传 统采用浸泡方式在纸片上形成冷水凝胶的工艺在纸片上形成的冷水凝胶较薄，因此本发明 在工艺上创造性地采用了多次高压喷洒冷水凝胶混合液的方式，使得纸片表面形成的冷水 冷胶膜层较厚，且膜厚度均一，更利于金黄色葡萄球菌的生长与菌落的形成，使试纸片对金 黄色葡萄球菌的检测更准确。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例1制得的冷水凝胶试纸片的成品；
[0029] 图2a为本发明实施例2的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测金黄色葡萄球 菌与单增李斯特菌的混合菌的特异性效果图；
[0030] 图2b为本发明实施例2的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测金黄色葡萄球 菌与副溶血性弧菌的混合菌的特异性效果图；
[0031] 图2c为本发明实施例2的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测金黄色葡萄球 菌与沙门氏菌的混合菌的特异性效果图；
[0032] 图2d为本发明实施例2的干扰性试验中利用冷水凝胶试纸片检测副溶血性弧菌 与沙门氏菌、单增李斯特菌的混合菌的特异性效果图；
[0033] 图3为本发明实施例4中冷水凝胶纸片检测呈阳性时的效果图；
[0034] 图4为本发明实施例4中冷水凝胶纸片检测呈阴性时的效果图。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明 所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
[0036] 实施例1快速检测试纸片的制备方法
[0037] 本实施例的一种金黄色葡萄球菌快速检测冷水凝胶试纸片的制备方法，所述方法 包括如下步骤：
[0038] (1)载体纸片制备：将层析滤纸切成5cmX5cm规格，经辐照或高压灭菌（高压后 于45°C恒温真空干燥）后备用；
[0039] (2)内包装袋制备：将耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，按试验要求压合成 5.lcmX5.lcm规格的联袋；
[0040] (3)基础培养基配制：每升混合培养基中含有蛋白胨5. 0~10. 0g、大豆蛋白胨 4. 0~6. 0g、酵母粉5. 0~10. 0g、氯化纳10. 0~15. 0g、丙酮酸钠3. 0~5. 0g、氯化锂3. 0~