一种诱导肿瘤特异性t细胞的组合因子及其获得肿瘤特异性t细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫细胞体外诱导分离培养领域，涉及一种诱导肿瘤特异性Τ细胞的 组合因子及其获得肿瘤特异性Τ细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤严重危害人类的生命与健康，其死亡率居各种疾病之首。据世界卫生组 织（WHO)和美国癌症协会预计，全世界每年新增约1200万的癌症新患者，约有800万癌症 患者死亡（每天有2万名癌症患者死亡）。中国目前有1000万癌症病人，肝癌、肺癌、乳腺 癌和前列腺癌等常见恶性肿瘤，近年来发病率明显上升，并呈年轻化趋势，严重威胁着人类 健康。
[0003] 肿瘤现有的三大常规治疗方法（即手术治疗、放射治疗及化学治疗）在过去的几 十年里为提高肿瘤患者的生存率做出了重大贡献，但始终无法解决肿瘤的转移和复发问 题，肿瘤患者的生存率近年来也不再有明显提高，可以说三大常规治疗已遭遇到疗效瓶颈， 迫切需要寻找新的能够突破肿瘤治疗疗效瓶颈的方法。
[0004] 肿瘤特异性T淋巴细胞（CTL)即细胞毒性T淋巴细胞，是从抗原递呈细胞接受了 抗原信息，并经过克隆扩增的可特异性识别和杀伤抗原特异性靶细胞的效应T淋巴细胞， CTL是机体清除癌变细胞的主要机制，在抗肿瘤免疫过程中发挥着主要作用。CTL不仅能通 过颗粒酶和穿孔素等物质直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌一些细胞因子如IFNy和 TNFa等间接地杀伤肿瘤细胞。随着生物医学，基因工程技术的发展，肿瘤特异性T淋巴细 胞治疗近年来日益受到重视，显示出良好的应用前景，多种特异性CTL诱导培养方案应运 而生。早在2000年日本用过继性T淋巴细胞移植治疗肝癌获得了很好的疗效，复发率降低， 生存率提高，研究发表在医学权威杂志《柳叶刀》上；2004年，Rosenburg教授研究的肿瘤浸 润淋巴细胞（TIL，特异性CTL的一类）在治疗转移性黑色素瘤上获得了良好的结果。肿瘤 特异性CTL治疗肿瘤疾病具有安全，靶向，高效的特点。这主要是由T淋巴细胞表面特异性 识别肿瘤抗原的T细胞受体（TCellReceptor,TCR)决定的。然而机体内针对各种抗原的 TCR千差万别，2014年《科学》杂志发表Rosenberg教授的文章，利用TCR免疫组库深度测 序技术从转移性胆管上皮细胞癌患者的肿瘤浸润T淋巴细胞群中，筛选并得到了肿瘤抗原 特异性的TCR序列，根据序列合成了TCR的DNA，并通过基因工程技术转导在患者自体T细 胞表面，获得了良好的治疗效果。
[0005] 随着各项临床应用的逐步开展，越来越多的临床结果表明肿瘤特异性CTL治疗的 有效性远远高于其它技术。美国国立癌症研究所进行的临床研究表明，在转移性黑色素瘤 患者身上联合使用肿瘤特异性CTL联合IL-2能产生50 %~70 %反应率。但是，肿瘤特异性 CTL的诱导培养需要消耗大量的时间，对技术的要求也很高，因此极大地限制了这项治疗 方法在癌症患者身上的广泛运用。早期有学者在动物试验中发现培养体系中加入IL-2后 可以扩增具有肿瘤细胞毒性的细胞，但研究发现该方法诱导细胞杀伤力不够强，诱导特异 性CTL效率低下。随后Rosenberg教授等开发了TIL技术研究，但TIL细胞难以获取的问 题限制了其临床应用。怎样选择一种能够有效诱导分离肿瘤特异性CTL的方法是目前CTL 技术亟待解决的问题。本研究采用抗原肽诱导培养联合IFNy富集的方法能有效获得肿瘤 特异性CTL，为特异性CTL临床应用和随后特异性T细胞表面受体的克隆研究奠定技术基 础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种有效诱导肿瘤特异性CTL的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种用于诱导肿瘤特异性T细胞的组合因子，其特 征在于，包括肿瘤特异性抗原、细胞因子IL-2、IL-7和IL-15。
[0008] 根据本发明的实施例，所述肿瘤特异性抗原为肿瘤抗原蛋白，肿瘤抗原长肽或库， 或肿瘤抗原短肽或库。
[0009] 根据本发明的实施例，在每毫升T细胞培养液中，肿瘤特异性抗原的用量是 l-50yg/ml，IL-2 的用量是 10-6000U/ml，IL-7 的用量是l-50ng/ml，IL-15 的用量是 l-50ng/ml〇
[0010] 根据本发明的实施例，在每毫升T细胞培养液中，肿瘤特异性抗原的用量是2μg/ ml，IL-2 的用量是 50U/ml，IL-7 的用量是 5ng/ml，IL-15 的用量是 5ng/ml。
[0011] 根据本发明的实施例，提供一种运用所述用于诱导肿瘤特异性T细胞的组合因子 来诱导培养并IFNγ富集获得肿瘤特异性Τ细胞的方法，其特征在于，步骤为：分离病人外 周血PBMC，用新鲜的无血清淋巴细胞培养液悬浮，细胞密度为2X106-5xl06/ml;加入所述的 用于诱导肿瘤特异性CTL的组合因子刺激，在37°C，5%C02培养箱中培养2-10天，用IFNγ 磁珠富集方法分离IFNγ阳性的抗原特异性Τ细胞即为肿瘤特异性Τ细胞。
[0012] 根据本发明的实施例，所述诱导培养并IFNy富集获得肿瘤特异性Τ细胞的方法 制备得到的肿瘤特异性T细胞用于制备临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗的药物或疫苗的用 途。
[0013] 根据本发明的实施例，所述肿瘤特异性抗原可以是合成的或商品化的肿瘤抗原蛋 白，肿瘤抗原长肽或肽库，或肿瘤抗原短肽或库。
[0014] 所述的无血清淋巴细胞培养液可以是Life Technology公司的AIM-V或其它无血 清培养基。
[0015] 本发明所述方法制备得到的抗原特异性T细胞用于T细胞受体克隆研究以及制备 临床细胞治疗和肿瘤免疫治疗药物或疫苗的用途。
[0016] 采用本发明所述组合因子以及培养分离方法所制备的肿瘤特异性T细胞（肿瘤 特异性CTL细胞）具有较高的纯度，能分泌高浓度炎症因子IFNγ，具有多态性较为专一的 TCR谱。本发明将在临床肿瘤免疫治疗的应用研究领域发挥重要作用。
[0017] 肿瘤特异性CTL细胞的诱导培养需要大量的时间进行抗原多轮刺激，诱导的细胞 群中CTL含量极低，筛选克隆CTL细胞对技术的要求很高，为了解决现有技术中的以上问 题，本发明提供的技术方案是：
[0018] 本发明提供一种用于诱导肿瘤特异性CTL细胞的组合因子，采用该组合物刺激外 周血PBMC能有效维持PBMC活性，进一步促进肿瘤特异性CTL细胞的增殖和活性，进而能更 有效地分泌抗肿瘤免疫炎症因子IFNy。
[0019] 本发明所述IL-2具有促进多种T细胞增殖维持其功能活性的作用，而IL-7和 IL-15是维持体内特异性CTL细胞活性的重要细胞因子。IL-7参与胸腺T淋巴细胞的成熟； 在人体外周环境中，它通过调控抗凋亡分子Bcl-2减少CTL的自发凋亡，促进记忆性CTL的 存活。IL-15能促进记忆性CTL细胞的增殖并加强他们的效应功能。本发明的发明人经过大 量创造性的劳动，惊奇的发现，当IL-2的用量是10-6000U/ml，优选50U/ml;IL-7和IL-15 的用量是l_50ng/ml，优选5ng/ml时，所诱导培养的PBMC含有较高纯度的特异性CTL，能高 水平分泌IFNy，同时非特异性T细胞活化的程度低。大量IL-2的应用将同时活化非特异 性T细胞，从而降低培养系统中特异性CTL的纯度。
[0020] 所述肿瘤特异性抗原的用量是1-50μg/ml，优选2μg/ml。当肿瘤特异性抗原的 用量为1μg/ml时，研究显示即能够成功诱导肝癌、肺癌、鼻咽癌、宫颈癌、肠癌等病人体内 肿瘤特异性CTL。其用量为2μg/ml时，肿瘤抗原特异性T细胞增殖效果较好。超过50μg/ ml的抗原用量将会大大提高不必要的经济成本。IL-2的用量是10-6000U/ml，优选50U/ml。 研究显示l〇U/ml低剂量IL-2对部分病人肿瘤抗原特异性T细胞增殖作用不明显，其用量 为50U/ml时，肿瘤抗原特异性T细胞增殖效果较好。超过6000U/ml的IL-2将会显著提高 非抗原特异性T细胞的增殖，使抗原特异性T细胞含量大幅降低，增加特异性CTL分离纯化 的难度。IL-7、IL-15的用量是l-50ng/ml，优选5ng/ml。低于lng/ml影响特异性CTL的