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【专利说明】生物分子分离和热加工
[oow] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年6月18日提交的美国临时申请序列号61/836, 461的权益，该 申请通过引用W其全部内容结合在此。 柳的]背景
[0004] 生物分子的分离是任何样品加工系统的关键部分。随着自动化分子分析系统的发 展，最大的限制在于样品的制备和祀样品的纯化。 阳〇化]对于所有生物化学过程来说，祀样品的分离和纯化是其成功的关键。生物化学分 析过程中的限制-焦憐酸测序、核酸连接、聚合酶链式反应、数字PCR、qPCR、核酸测序、蛋白 检测/蛋白强化、遗传珠涂覆（geneticbeadcoating)、稀少细胞检测W及细胞富集-并且 不限于运些，归因于祀标的起始浓度W及分析中使用的反应样品内存在的生物化学抑制剂 的水平。
[0006] 对于大多数生物化学分析，要对样品进行一系列预分析步骤W从最初样品中分离 祀标并且去除生物化学抑制剂。典型地，运些步骤是费时和费力的并且最终降低祀标的起 始浓度。 阳007] 当前优选的样品纯化方法利用旋转离屯、柱（spincolumn)。然而，旋转离屯、柱需要 多个离屯、步骤，并且因此不可与自动化DNA文库制备平台整合。类似地，用于从琼脂糖凝胶 中纯化核酸片段的纯化技术也需要多个离屯、步骤W实现核酸分离。
[0008] 用于样品纯化的一项技术是基于顺磁性珠粒的纯化。该方法提供了一种可提供改 进的DNA恢复率和可调缓冲条件的途径，运些条件可W用于选择性地结合特定的DNA片段 大小。
[0009] 该基于顺磁性珠粒的纯化是一种静态孔分批法。当前的方法设及将珠粒混合 物-顺磁性珠粒和一种缓冲液-连同最初样品移液至一个微量滴定板的一个孔中。将该溶 液移液、混合、并在室溫下解育W使DNA结合至运些珠粒。然后将该微量滴定板置于一个磁 性板上。具有该结合的dm的运些珠粒移动到该板的边缘并且被磁体保持。接下来，使用 移液管将上清液（包含废物）去除并且丢弃。然后进行多个洗涂步骤W去除存在于珠状小 球上/处的残余废物。将乙醇移液至含有该珠状小球的板，解育并且然后使用移液管去除。 重复该洗涂步骤两次。然后添加洗脱缓冲液。将该板从该磁性板中移除，并且通过移液管 混合将该洗脱缓冲液混合。将该微量滴定板放回到该磁性板上。然后，使用移液管将含有 经纯化的DNA的洗脱液取出。
[0010] 该基于顺磁性珠粒的方案是一项劳动密集型过程并且由于需要大量移液步骤而 不容易自动化。移液步骤数量多还导致最初和最终样品体积大，从而导致每数据点的高试 剂成本。
[0011] 一种应用并且不限于该应用是为了用于下一代测序平台的改进的样品纯化。很多 下一代测序平台需要多个由特定范围内的碱基对长度的DNA片段组成的DNA文库。此外， 运些DNA片段需要用特定核巧酸序列（接头）进行标记W使得使用PCR对运些序列进行扩 增并且使得运些文库片段退火至测序仪流动池。当在单一流动池内复用样品时，还可W向 运些DM片段中添加序列特异性指标W识别单独样品。DM的标记片段化（tagmentation) 值ΝΑ被片断化并用接头进行标记）W及常用接头和指标的添加在两个单独的生物反应中 实现。在运些反应后，清洁该DNA文库W移除过量的核巧酸、酶、引物、盐及其他污染物。因 此，标记片段化DNA、纯化经标记片段化的DNA、添加常用接头和指标W及纯化最终文库产 物所需要的工作流程是复杂且劳动密集型的。
[0012] 本文概述的系统和方法可有助于实现无污染、低体积、高通量、低成本和/或高样 品浓度的样品处理。
[0013] 概述
[0014] 用于使用顺磁性珠粒进行生物分子分离和处理的装置、系统和方法。
[0015] 附图简要说明
[0016] 图1是一个示出基于连续流毛细管的纯化系统的图。
[0017] 图2是一个示出基于双向流毛细管的纯化系统的图。
[0018] 图3是一个示出用于该基于连续流毛细管的纯化系统的磁性清除步骤的图。
[0019] 图4示出了可W作为控制器编程实施的方法。
[0020] 图5示出了可W作为控制器编程实施的方法。
[0021] 图6示出了可W作为控制器编程实施的方法。
[0022] 图7显示了分光光度计法结果，证明了对照方案和毛细管清除方案之间的可比回 收率。对基于对照珠粒纯化和基于毛细管珠粒纯化两者的回收/洗脱的DNA(肌动蛋白0 扩增子）的浓度进行绘图。
[002引图8显示了凝胶图像，示出了用于对照清除和毛细管清除的化xtera产物涂片。 [0024] 图9显示了qPCR结果，示出了从对照方案和毛细管清除方案中回收的化xtera产 物。
[00巧]图10显示了凝胶结果，证实了在毛细管中使用基于珠粒纯化的285bp扩增子进行 的回收。将未纯化的产物（泳道102,103)与纯化的产物（泳道104,105)相比，很清楚，非 特异性产物如引物二聚体被成功除去（泳道101是梯状条带（ladder))。
[0026] 图11显示了毛细管净化-可复用性实例的qPCR结果。
[0027] 图12示出了可W作为控制器编程实施的方法。
[0028] 图13示出了可W作为控制器编程实施的方法。
[0029] 图14示出了可W作为控制器编程实施的、具有光学分析的细胞富集的方法。
[0030] 图15示出了可W作为控制器编程实施的细胞富集的方法。
[0031] 图16示出了可W作为控制器编程实施的、使顺磁性珠粒功能化的方法。
[0032] 图17示出了可W作为控制器编程实施的、清洗和移除已使用的顺磁性珠粒的方 法。
[0033] 图18示出了可W作为控制器编程实施的、与复合液体池技术相互作用的方法。
[0034] 图19显示了平行导管加热头的图。
[0035] 图20显示了可W作为顺磁性珠粒净化仪实施的装置。
[0036] 详细描述
[0037] 在一些实施例中，本披露提供了用于在导管内分离生物分子的系统和方法。该导 管可W具有任何方向的流动并且被一个控制器所控制。 阳03引在一个实施例中，参照图1A，包含顺磁性珠粒的小块（slug)和样品2W及不混溶 流体缓冲剂3在一个导管1内流动。该样品可W包括祀生物分子、生物化学过程抑制剂和污 染物。该导管在沿着长度的一个位置具有一个产生磁场的源4,该源位于一个热控制区域。 参照图1B，运些顺磁性珠粒和样品小块2W及洗脱缓冲液小块5被不混溶流体3分隔。运 些顺磁性珠粒和样品小块2在限定的溫度下到达该磁场源4,此时运些珠粒被捕获于该磁 场内。参照图1C，运些顺磁性珠粒和样品小块2继续在导管1内流动，同时运些具有所结合 的祀生物分子6的顺磁性珠粒保持被该磁场源捕获。参照图1D，该洗脱缓冲液5到达该磁 场源并且包住运些被捕获的顺磁性珠粒。随着它沿着该导管1流动，所结合的祀生物分子 被释放到该洗脱缓冲液中。参照图1E，该洗脱缓冲液和祀生物分子7继续在该导管1内W 供分配或进一步分析。
[0039] 在一个实施例中，参照图2A，继运些祀生物分子在该洗脱缓冲液24中释放之后， 顺磁性珠粒23在该导管20中的磁场和热源22处形成，流动逆转。参照图2C，通过该磁场 源和热区域22,该洗脱缓冲液和祀生物分子回到该流动中越过运些被捕获的顺磁性珠粒 23W回到最初的抽吸位置W供分配。
[0040] 在一个实施例中，该洗脱缓冲液和祀生物分子处于在未施加磁场的活动热区域里 的溶液中的具有运些磁珠颗粒的流动中。运些颗粒可被保持一段时间，并且然后该磁场被 激活并且运些颗粒被固定。
[0041] 在一个实施例中，参照图3A，继在该洗脱缓冲液36中的运些祀生物分子从被该导 管31中磁场源34在受控溫度下捕获的运些顺磁性珠粒35中释放之后，该不混溶流体33 之后是珠粒去除和清理小块32。参照图3B，当该珠粒去除和清理小块32包住运些顺磁性 珠粒35时，去除该磁场源34 (物理地或更改为关闭状态）。参照图3C，运些顺磁性珠粒35 发生反应进入该去除和清理小块32中并且随着小块37继续沿导管31流动。该珠粒去除 和清理过程允许该导管31的再次使用并且防止样品的任何交叉污染。
[0042] 在一些实施例中，一个加热元件可W位于该磁场源附近。该加热元件可W由该控 制器控制。该加热元件可W位于靠近该捕获位点处，使得当运些磁性颗粒被固定或在该小 块内捕获位点处W及该加热元件被激活时，该加热元件可W加热运些磁性颗粒。在某些实 施例中，运些加热元件可W包括但不限于，带状加热器、板带加热器、表面加热器、筒式加热 器、福射源、加热液体源W及浸没式加热器。该加热元件可W被配置成施加热量至该导管 或至任何其他结构，导致热量转移至运些磁性颗粒。当该加热元件被激活时，该导管和/ 或运些颗粒可W在从约15°C到约150°C，从约25°C到约95°C或从约32°C到约68°C的溫度 下被加热。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒在约25°C、约30°C、约35°C、约40°C、 约 45°C、约 50°C、约 55°C、约 60°C、约 65°C、约 70°C、约 75°C、约 80°C、约 85°C、约 90°C或约 95°C的溫度下被加热。在某些实施例中，该导管在一个预定位点处被加热，从而限定一个热 区域。在某些实施例中，由于该导管被加热，固定在该热区域中的颗粒被加热。该导管和/ 或运些颗粒在高溫下可保持从约1分钟至约270分钟的一段时间。在某些实施例中，该导 管和/或运些颗粒在高溫下可保持约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约 10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、 约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分 钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、 约150分钟、约160分钟、约170分钟、约180分钟、约190分钟、约200分钟、或约210分钟 的一段时间。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒在高溫下可保持从约1分钟至约90 分钟或从约1分钟至约60分钟的一段时间。在某些实施例中，对于较低浓度样品（即范围 为从约1拷贝/mL高达约104拷贝/μL)，该导管和/或运些颗粒在高溫下可保持从约15 分钟至约270分钟或从约30分钟至约180分钟的一段时间。在某些实施例中，较低浓度样 品是具有从约1拷贝/mL至约104拷贝/μ^或从约0. 01拷贝/μL至约10 3拷贝/μ^ 或从约0. 1拷贝/μL至约100拷贝/μL、或从约1拷贝/μL至约10拷贝/μL的浓度的 样品。在某些实施例中，较低浓度样品是具有约0.001拷贝/μ^0. 01拷贝/μ^约0.05 拷贝/μ^约0. 1拷贝/μ^约0. 5拷贝/μ^约1拷贝/μ^约5拷贝/μ^约10拷贝/ μ L、约50拷贝/μ L、约100拷贝/μ L、约500拷贝/μ L、约1〇3拷贝/μ L或约104拷贝/ μL的浓度的样品。
[0043] 可替代地，一个能够冷却而不加热运些颗粒的冷却元件可W位于该磁场源附近。 在一些实施例中，可能的冷却元件可W包括但不限于，热电模块，冷冻装置，液体冷却装置。 在某些实施例中，该导管在一个预定位点处被冷却。在某些实施例中，由于该导管被冷却， 固定在该预定位点处的颗粒被冷却。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒可W被保持 在从约-6Γ到约6(TC的溫度下。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒可W被保持在从 约-4°C到约40°C的溫度下。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒可W被保持在从约 4Γ到约28Γ的溫度下。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒可W被保持在约-6Γ、 约-4°C、约-2°C、约 0°C、约 2°C、约 4°C、约 6°C、约 8°C、约 10°C、约 12°C、约 14°C、约 16°C、 约 18°C、约 20°C、约 22°C、约 24°C、约 26°C、约 28°C、约 30°C、约 32°C、约 34°C、约 36°C、约 38°C、或约40°C的溫度下。该导管和/或运些颗粒在一个溫度下可保持从约1分钟至约270 分钟的一段时间。在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒在一个溫度下可保持约1分钟、 约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约 30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约65分钟、 约70分钟、约75分钟、约80分钟、约85分钟、约90分钟、约95分钟、约100分钟、约110分 钟、约120分钟、约130分钟、约140分钟、约150分钟、约160分钟、约170分钟、约180分 钟、约190分钟、约200分钟，或约210分钟的一段时间。在某些实施例中，该导管和/或运 些颗粒在一个溫度下可保持从约1分钟至约90分钟或从约1分钟至约60分钟的一段时间。 在某些实施例中，该导管和/或运些颗粒在一个溫度下可保持从约15分钟至约270分钟或 从约30分钟至约180分钟的一段时间。在某些实施例中，较低浓度样品是具有从约1拷贝 /血至约10 4拷贝/μL、或从约0. 01拷贝/μL至约10 3拷贝/μL、或从约0. 1拷贝/μL至 约100拷贝/μL或从约1拷贝/μL至约10拷贝/μL的浓度的样品。在某些实施例中， 较低浓度样品是具有约0. 001拷贝/μLO. 01拷贝/μ^约0. 05拷贝/μ^约0.1拷贝/ μレ约0.5拷贝/μレ约l拷贝/μレ约5拷贝/μレ约10拷贝/μレ约50拷贝/μレ约 100拷贝/μL、约500拷贝/μL、约1〇3拷贝/μL或约