一种圆台细胞捕获芯片及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞捕获工具技术领域，具体涉及一种圆台细胞捕获芯片及其制备方法，该微流体细胞捕获芯片可用作为肿瘤诊断、辅助治疗及生化分析研究的工具。
【背景技术】
[0002]对许多癌症患者而言，其死亡主要是由于转移瘤引起的。当病人手术切除主要肿瘤后，目前肿瘤检测手段很难及时反应治疗情况，鉴定转移瘤，指导后续的放化疗过程，从而导致病人错过最佳治疗时机和无法及时有效调整无效治疗和用药方案。因此不能够成功治疗多有的转移瘤，导致病人最终死亡。从临床角度看来，转移瘤可以看作是癌症自然发展过程中的结论性事件。
[0003]人们急待开发非创伤性过程从患者提取肿瘤细胞样品的工具。
[0004]循环肿瘤细胞(CTCs)是指血液中以极低水平存在的活实体细胞。随着对循环肿瘤细胞研究的不断深入，富集和鉴定这些细胞已经成为辅助癌症诊断的一种方法。监管机构(例如FDA)已经批准一些基于循环肿瘤捕获、鉴定系统的临床应用。
[0005]为了分离和富集体液中的循环肿瘤细胞和扩散肿瘤细胞，人们利用这类细胞尺寸、表面分子表达等特点开发出一些相应的捕获、富集方法(例如专利CN102925337B)。
[0006]专利CN102925337B利用不同的细胞尺寸大小，在楔形沟道里面会卡住，同样尺寸的细胞会停留在微流体细胞捕获芯片的同一个高度的位置。该专利的缺点是细胞在同一个位置会富集太多，一些大细胞在上游位置被卡住，会挡住一些小细胞，导致有一些小细胞无法被冲洗到下游位置，影响目标细胞分离、富集的效果，从而影响对目标细胞的分析结果。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种圆台细胞捕获芯片及其制备方法，该芯片结构简单，操作方便，成本低廉，且能快速准确地捕获目标细胞。该方法工艺流程简单，所需的辅助设备和试剂均较少，制备成本低廉。
[0008]实现本发明上述目的所采样的技术方案为:
[0009]—种圆台细胞捕获芯片，至少包括透明玻璃基底和透明玻璃盖片，透明玻璃基底的一侧面刻蚀有凹槽，凹槽呈圆台状，凹槽的深度为10?lOOum，凹槽底面的面积最小，凹槽开口的面积最大，凹槽底面的中心开设有入口，凹槽开口的边缘上设有一个以上的出口，透明玻璃基底开设有凹槽的侧面与透明玻璃盖片的一侧面固定紧贴为一体。
[0010]所述的凹槽开口的直径为15?20毫米，凹槽底面的直径为1?5毫米。
[0011]出口有4个，4个出口沿圆周方向均匀分布于凹槽开口的边缘上。
[0012]凹槽开口的边缘上设有环形的导水槽，4个出口均匀分布于导水槽内。
[0013]所述的入口和出口均为圆形通孔，入口和出口的直径为0.6-2毫米。
[0014]—种圆台细胞捕获芯片的制备方法，包括如下步骤:
[0015]1)选取三片尺寸完全相同的透明玻璃，分别作为透明玻璃基底、透明玻璃盖片和透明玻璃辅助基片，将透明玻璃基底的一侧面进行覆膜，在透明玻璃基底覆膜的侧面中央裸露出需要刻蚀的圆形区域；
[0016]2)将覆膜好的透明玻璃基底置于浓硫酸中浸泡0.5-24小时，使透明玻璃基底上需要刻蚀的圆形区域的表面呈亲水性；
[0017]3)在透明玻璃辅助基片中心上开设一个玻璃刻蚀液注入孔，再在透明玻璃辅助基片一侧面均匀涂覆一层石蜡，使透明玻璃辅助基片涂覆石蜡的表面呈疏水性；
[0018]4)将透明玻璃基底放置于平台上，使透明玻璃基底覆膜的侧面朝上，在透明玻璃基底两端上对称放置两钢片，接着将透明玻璃辅助基片置于两钢片上，使透明玻璃辅助基片涂覆石蜡的侧面朝下，同时使透明玻璃基底和透明玻璃辅助基片的垂直投影完全重合，再固定好透明玻璃基底和透明玻璃辅助基片；
[0019]5)用注射栗将玻璃刻蚀液以lul/h?200ul/h的注入速度通过注入孔注射到透明玻璃基底需要刻蚀的圆形区域的中心上，由于注入玻璃刻蚀液会不停地向四周散开，从而使透明玻璃基底需要刻蚀的圆形区域的正中央刻蚀的深度最深，边缘的深度最浅，刻蚀深度沿需要刻蚀的圆形区域的径向逐渐减小，进而在透明玻璃基底形成圆台形的凹槽；
[0020]6)在凹槽底面的中心开设一个通孔，即为入口，再在凹槽开口的边缘开设一个以上的通孔，即为出口 ；
[0021]7)将透明玻璃基底开设有凹槽的侧面和透明玻璃盖片的任一侧面进行水键合，待水挥发完全，进行高温烧结，透明玻璃基底和透明玻璃盖片成熔合成为一体，得到该圆台细胞捕获芯片。
[0022]所述钢片的厚度为0.1-2.0mm。
[0023]需要刻蚀的圆形区域的直径为15?22mm。
[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于:
[0025]1)该芯片结构简单，使用方便，能快速准确地捕获目标细胞。该芯片是利用不同目标细胞的尺寸进行捕获这些目标细胞，能同时捕获所有的目标细胞，且捕获所需的时间短。
[0026]2)本芯片采用的是圆环捕获方法，使目标细胞在圆形的捕获区域进行捕获，捕获区域变大，从而使尺寸较小的细胞被尺寸较大细胞挡住的几率变小，从而使目标细胞分离、富集的效果变好，进而使目标细胞分析结果会更加准确。
[0027]3)该制备方法工艺流程简单，所需的辅助设备或工具较少且非常常见，所需的刻蚀液的量较少，因而可操作性非常强，制备成本低廉，适合大批量生产以及推广应用。
【附图说明】
[0028]图1为本发明提供的圆台细胞捕获芯片的结构示意图。
[0029]图2为透明玻璃基底的结构示意图。
[0030]图3为利用该圆台细胞捕获芯片捕获目标细胞的显微镜图。
[0031]其中，1-透明玻璃盖片、2-透明玻璃基底、3-凹槽、4-入口、5-出口、6-导水槽。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图对本发明提供的圆台细胞捕获芯片进行详细说明。
[0033]本发明提供的圆台细胞捕获芯片的结构如图1所示，该细胞捕获芯片包括透明玻璃基底2和透明玻璃盖片1。
[0034]透明玻璃基底2 —侧面刻蚀有凹槽3，凹槽3呈圆台状，凹槽3底面的面积最小，凹槽3开口的面积最大，如图2所示。凹槽的深度为10?lOOum，凹槽开口的直径为15?20mm，凹槽底面的直径为1?5mm。凹槽3底面的中心开设有入口 4，凹槽开口的边缘上环形的导水槽，导水槽横截面呈半圆形，导水槽横截面的直径为1.0_。导水槽内沿圆周方向均匀设有4个出口 5，出口和入口均为圆形通孔，入口和出口的直径为0.6-2mm。
[0035]透明玻璃基底2开设有凹槽的侧面与透明玻璃盖片1的一侧面固定紧贴为一体，这样做的目的是使微流体(含目标细胞的流体)不能从透明玻璃基底和透明玻璃盖片之间的缝隙流出，只能从出口流出，便于捕获目标细胞。
[0036]该圆台细胞捕获芯片捕获细胞的原理如下:
[0037]由于凹槽呈圆台形，凹槽侧面不同地方处与透明玻璃盖片的距离是不断地变化的，即凹槽侧面从入口到出口与透明玻璃盖片形成的空间是不断变小的，当人体液体样本通过入口流入圆台形凹槽时，由于受到空间的限制，随人体液体样本流入的目标细胞将在特定的位置卡住，这样就能将不同尺寸的目标细胞捕获，最终使不同尺寸的目标细胞在通过凹槽时实现自动分离和富集。
[0038]利用该圆台细胞捕获芯片捕获目标细胞的方法如下:
[0039]1)将待检测人体血液样本从芯片的入口注入；
[0040]2)将磷酸盐缓冲溶液(即PBS溶液)从芯片的入口注入，以100ul/min的速度对凹槽进行清洗；
[0041]3)将示踪物质(如:染细胞核的荧光染料如DAPI或者Hoechst染料)或免疫试剂从芯片的入口注入，对目标细胞进行识别；
[0042]4)再次将磷酸盐缓冲溶液(即PBS溶液)从芯片的入口注入，对以100ul/min的速度对凹槽进行清洗；
[0043]5)将芯片置于显微镜下观察捕获的目标细胞。
[0044]捕获效果分析:
[0045]如图3所示，分别选择区域一和区域二两个观测区域，可以看到目标在上述芯片中的分离和富集，在上述两个观测区域观测到的目标细胞的分布可以看出，目标细胞的分离和富集是目标细胞的尺寸和圆台形凹槽的尺寸相互作用的结果。
[0046]下面结合实施例对本发明提供的圆台细胞捕获芯片的制备方法进行说明。
[0047]实施例1
[0048]1)选取三片长75mm、宽25mm和厚1.1mm的透明玻璃，分别作为透明玻璃基底、透明玻璃盖片和透明玻璃辅助基片，将透明玻璃基底的一侧面进行覆膜，在透明玻璃基底覆膜的侧面中央裸露出需要刻蚀的圆形区域；
[0049]2)将覆膜好的透明玻璃基底置于分析纯的浓硫酸中浸泡5小时，使透明玻璃基底上需要刻蚀的圆形区域的表面呈亲水性；
[0050]3)在透明玻璃辅助基片中心上开设一个直径为1.0mm的玻璃刻蚀液注入孔，再将透明玻璃辅助基片一侧面均匀涂覆一层石蜡，使透明玻璃辅助基片涂覆石蜡的表面呈疏水性；
[0051]4)将透明玻璃基底放置于平台上，使透明玻璃基底覆膜的侧面朝上，在透明玻璃基底两端上对称放置两钢片，钢片的厚度即为透明玻璃基底与透明玻璃辅助基片之间的距离，钢片的厚度为1mm，接着将透明玻璃辅助基片置于两钢片上，使透明玻璃辅助基片涂覆石蜡的侧面朝下，同时使透明玻璃基底和透明玻璃辅助基片的垂直投影完全重合，再固定好透明玻璃基底和透明玻璃辅助基片；
[0052]5)用注射栗将玻璃刻蚀液(广州美迪新玻璃材料有限公司购买，也可以其他市售的玻璃刻蚀液)从注入孔垂直注射到透明玻璃基底需要刻蚀的圆形区域的中心上，玻璃刻蚀液的注入速度为lOul/h，由于注入玻璃刻蚀液会不停地向四周散开，透明玻璃基底需要刻蚀的圆形区域的正中央刻蚀