一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮能力的快速评估方法。
【背景技术】
[0002] 大气中氮气的比例占79%，但是所有的动植物W及大多数微生物都不能利用分子 态氮作为氮源，而所有的生命都需要氮。生物固氮是指微生物将氮还原为氨的过程。据联 合国粮农组织（FAO) 1995年的粗略估计，全球每年由生物固氮作用固定的氮量接近2X 1〇6 吨，占全球植物需氮量的约3/4。根据固氮微生物与高等植物W及其他生物的关系，可W分 为H大类：自生固氮体系、共生固氮体系和联合固氮体系。共生固氮是自然界最主要的固氮 体系，包括根瘤菌与豆科植物、弗兰克氏菌与非豆科植物、固氮藍细菌与植物W及藍细菌与 真菌的共生体地衣等，其中根瘤菌与豆科植物的共生固氮最为突出。根瘤菌共生固氮是在 豆科植物根瘤共生组织中进行的生理过程，根瘤的固氮活性和固氮效率将直接决定了豆科 植物的生理特征。
[0003]豆科植物是我国重要的经济作物。W大豆为例，大豆生长过程中，大豆植物与大豆 根瘤菌形成的固氮共生体是大豆氮源的主要摄取途径，大豆根瘤固氮共生体固氮能力的强 弱直接影响着大豆的产量和品质，对大豆种植有着非常重要的指导意义。在此过程中，对大 豆根瘤固氮共生体中根瘤菌编码的固氮酶活性的检测，是评估其固氮能力的基础指标。但 由于固氮酶本身不易提取且容易失活，另外受限于根瘤菌的生理特性，编码固氮酶的相关 基因仅在共生状态下进行表达，因此目前对于固氮效率的检测多采用间接方法。
[0004]目前，1?同位素稀释法是确定豆科植物和根瘤菌固氮共生体固氮能力的常用方 法，该方法检测指标直接，但检测周期长，并且需要提前施用同位素，所W不能用于田间检 巧IJ，也不能做到实时检测。因此，实际农业产生需要一种能够快速低成本评估大豆根瘤固氮 共生体固氮能力的方法。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种豆科植物根瘤固氮共生体固氮效率的快速、实时评估豆科植物根 瘤固氮共生体系固氮能力的方法。
[0006] ni巧基因是根瘤菌固氮酶的结构基因，存在于nif基因簇，其编码产物是固氮酶 的结构组分，nif基因是固氮的关键基因。
[0007] 本发明通过提取根瘤总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA，英光定量PCR检测利用 ni巧基因的表达丰度的检测，可W分析不同环境中豆科植物根瘤固氮共生体中固氮酶基因 的转录效率，进而间接评估不同实验或田间条件下的豆科植物与根瘤菌的共生固氮效率的 变化。
[000引
【发明内容】
包括：
[0009] -种豆科植物根瘤固氮共生体系固氮能力的快速评估方法，包括：
[0010] 一；植物-根瘤菌转录本信息共提取；（1)设定对照组和待测组，对照组和待测组 分别由一个或两个W上样本组成，分别提取各样本根瘤总RNA; (2)用分光光度计分别检测 各样本中提取的总RNA，得到总RNA的浓度和质量；
[0011]二：固氮酶基因转录水平原位检测；（1)分别将对各样本的mRNA反转录成CDNA; (2)分别用英光定量PCR方法转录各样本的固氮酶ni巧基因和参比基因16s，并用2AAEt方法计算待测组相对于对照组，固氮酶nifH基因的相对转录丰度；
[0012] H;W固氮酶基因ni巧的相对转录丰度来评估大豆根瘤固氮共生体的固氮能力。
[0013] 所述样本取自一株或两株W上相同品种豆科植物。同组样本中，豆科植物处于相 同生长环境下；组间样本中，豆科植物生长环境不同
[0014] 具体而言包括如下步骤：
[0015] (1)设定对照组及待测组，分别取对照组及待测组内各个样本的新鲜根瘤 50-200mg，在液氮中研磨成细粉状，立即加入RNA提取液l-2ml，继续研磨成匀浆；
[0016] (2)将匀浆l-2ml转移到离必管中，加入200-400U1氯仿，混匀；
[0017] (3)加入50-100ulRNase-free(1地2〇 及50-200U1氯仿，混匀，离必5-20分钟， 4°C，12,000Xg-16,000X邑；
[0018] (4)将600u^800ul上清液转移到RNase-化ee离必管中，加入等体积的异丙醇，混 匀，离必 5-20 分钟，12, 000Xg-16, 000Xg，弃上清；
[0019] (5)加入l-2ml70-80%己醇，混匀，6000Xg-8000Xg离必4-7分钟，倒出液体，留 沉淀；
[0020] (6)加入 30-lOOulRNase-freed地2〇,混匀；
[0021] (7)分光光度计分别测定各样本的RNA浓度和质量，并用RNase-化ee(1地2〇将各 样本稀释成同样浓度；（第一，检测RNA质量是否可W进行后续实验，第二，确定RNA浓度方 便后续反转录实验统一RNA质量）
[002引 做获得的RNA进行反转录，将mRNA逆转录成cDNA;
[002引 （9)采用英光定量PCR(Real-timePCR)，WCDNA为模板分别扩增个样本的固氮酶 基因ni巧和参比基因16s;
[0024] (10)根据Real-timePCR得到的Ct值，用2AAEt方法计算分析待测组相对于对 照组，固氮酶基因ni巧的相对转录丰度；
[002引 （11)Wni巧基因的相对转录丰度来评价固氮能力，当相对转录丰度为1时，表 明待测组相对于对照组，固氮能力相同；当相对转录丰度低于1时，表明待测组相对于对照 组，固氮能力低；当相对丰度大于1时，表明待测组相对于对照组，固氮能力高。
[0026] 步骤（1)中，取新鲜根瘤lOOmg，RNA提取液为TrizolA+,加入量为Iml;步骤（2) 中，将匀浆Iml转移到化aseLockGel管，加入400ul氯仿，混匀。
[0027] 步骤（2)和步骤（3)中，所述混匀后，将匀浆分别冰上放置5-20和3-7分钟，氯仿 加入量分别为400ul和200ul。
[002引步骤做和步骤（4)中，所述离必为4。12, 000Xg,离必15分钟。
[0029] 步骤巧）中75 %己醇加入量为1ml，所述离必为4。7500Xg,离必5分钟。
[0030] 步骤化）中室温放置2-3分钟后，加入30ulRNase-freed地2〇。
[0031]步骤（8)中逆转录反应体系为30ul反应体系，由下列成分组成：
[0032] 成分 用豐 5PrIftierScript#Buffer(forRealTlrae) 6ul PrimerScrlPU臣RT' MixlI.. 5uI Random6niers(IOOuM) '2.Oul RNA鶴板 15OOng (加、陵积報据最终浓度嫉算）RNase-freeddH20 朴盤 3OuI
[0033]PCR扩增条件为；37°c，45min-60min;85°C，5s〇
[0034] 步骤（9)中英光定量PCR方法采用相对定量方法，内参基因选择16S，目标基因为 固氮酶结构基因ni巧；反应体系为25ul反应体系，由下列成分组成：
[0035] 成分 属疊 SYBR^ Fremix Ex TaqM 12. Syl Primer F ( l.Opniol/ aU I.uI P I: I打]e r R U 0 pmo! / U .0 1 ii I ClMA模據猶释M裕加U!.l 淑恥0 9, 5ul
[0036]Real-timePCR扩增条件为；94°C变性 5min，94°C变性 30sec，58°C退火Imin，72°C 延伸Imin，共40个循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
[0037] 本发明的优点在于：
[0038] 1)操作步骤简单、方便，全部操作分析过程可在一个工作日内完成；
[0039] 2)通过修改RNA提取过程中各类试剂的添加量，提取得到的植物-根瘤总RNA质 量较高，可W从图1中看出，RNA浓度达到lOOOng/ulW上，A260/A280在1.8-2. 0之间。
[0040] 3)通过调整整合RNA提取W16S基因的转录丰度为参比对照，通过计算基因转 录丰度的比率，反转录及实时英光定量PCR方法可W准确稳定的评估，最终可W达到检测 ni巧基因的转录水平来指示根瘤固氮豆科植物共生体固氮能力效率的变化，从图3和图4 中可W看出，本发明针对ni巧基因转录变化的检测分析结果和同位素稀释法检测分析的 共生固氮酶活性变化的结果表现一致。
[0041] 4)本方法适合用于田间快速、实时评估±壤环境干预下（农药或污染物等）豆科 植物根瘤固氮共生体固氮能力的变化。
【附图说明】
[0042] 图1为分光光度计检测总RNA的结果图；
[004引图2是英光定量PCR的扩增曲线（左）和烙解曲线（右）图；
[0044] 图3是氯嚼礙隆胁迫处理下固氮酶基因ni巧的表达效率变化图；
[0045] 图4是用稳定同位素1?稀释法检测的氯嚼礙隆胁迫处理下共生根瘤固氮酶活性 的变化。
【具体实施方式】
[0046] 本发明所述参数组合是经过实验设计优化而得，与现有提取方法相比，可W用较 少的根瘤样本巧Omg即可），W相对较短的时间，提取出质量较高的RNA样本。W下实施例 用于进一步说明本发明，但发明不限于实施例。
[0047] 实施例1 ;
[0048] 本实验原位检测根瘤菌固氮酶基因的表达效率，并评估固氮能力的方法按W下步 骤进行：
[0049] 对照组；无菌歴石盆栽实验；
[0050] 待测组；与对照组相同的无菌歴石盆栽实验，分别加入氯嚼礙隆除草剂A)正常田 间用量（20ug/kg)、B)5倍田间用量（100ug/kg)、C)25倍田间用量巧OOug/kg)。
[0051] 每组包括3个样本，每个样本取自3株大豆植株。
[0052] 每个样本取大豆根瘤lOOmg，用自来水冲洗干净后，立即放入液氮制冷；研鉢和 梓于12rC灭菌20min，烘干，研磨前用液氮预冷；研磨成细粉状时，立即加入RNA提取液 TrizolA+lml，继续研磨成匀浆
[0053] (1)将Iml匀浆转移到离必管中（离必管用前12,OOOXg离必30s)，冰上放置15 分钟后，加入200--400U1，如300ul氯仿，上下颠倒混匀；
[0054] 似加入75ulRNase-freed地2〇及IOOul氯仿，颠倒混匀，冰上放置5分钟后， 4°C，12, 000Xg离必5-20分钟，如15分钟，；
[00巧](3)将700ul上清液转移到新的RNase-化ee离必管中，加入等体积的异丙醇，上下 颠倒混匀，冰上放置20-30分钟，离必5-20分钟，如15分钟，