一种制备利拉鲁肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种合成利拉鲁肤的方法，具体地设及利拉鲁肤主链的化学合成方 法。 技术背景
[0002] 利拉鲁肤（CAS:204656-20-2)是膜高糖素样肤1 (GLP-I)的类似物，它承担着 GLP-I受体激动剂的作用，它与GLP-I有97%的相似性，用于2型糖尿病人控制血糖，适用于 单用二甲双脈或横脈类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，由诺和诺德公 司研制，2009年在欧盟首次上市，2011年在中国获准上市。它的序列为：L-Histicbd-L-Al anyl-L-曰-Glutamylglycyl-L-Threonyl-L-Phenylalanyl-L-Threonyl-L-Seryl-L-曰-As partyI-L-ValyI-L-SeryI-L-SeryI-L-TyrosyI-L-LeucyI-L-口 -Glutamylglycyl-L-Gluta minyl-L-Alanyl-L-Alanyl-N6-阳-(1-Oxohexadecyl) -L-y-Glutamyl] -L-Lysyl-L- 口-Gl utamyI-L-Phenylalanyl-L-Isoleucyl-L-Alanyl-L-Tryptophyl-L-Leucyl-L-Valyl-L-Ar ginylglycyl-L-Arginyl-Glycine。
[0003] 诺和诺德的工艺采用是生物和化学相结合的方法生产利拉鲁肤，其中用生物发酵 法合成主链肤，主链经过纯化后与侧链进行化学反应后得到利拉鲁肤，由于生物发酵工艺 不适用于大工业规模生产，所W利拉鲁肤主链的化学合成方法就显得尤为重要。
[0004] 该多肤的主链有31个残基，与GLP-I的序列相比，仅有的区别是34Lys变为34ArgD 由于GLP-I被称为GLP-I(7-37)，所W目前利拉鲁肤的主链也是从7-37来进行编号，由于 其主链跟GLP-I只有一个氨基酸的区别，所W可W命名为34ArgGLP-I(7-37)，其序列为H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-L yS-Glu-Phe-Ile-Ala-T;rp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH除 了在主链上有一个残基的区 另IJ外，在26Lys的侧链上有一个栋桐酸和Glu的二肤，正是有了运个结构，才使得改造后的结 构人体内的稳定性大大增加。
[0005] 目前所报道的专利合成利拉鲁肤合成方法包括两种，一种是将主链肤 34ArgGLP-I(7-37)合成好，然后在侧链Lys26上偶联Glu及栋桐酸，例如US6268343B1、 US6458924B2就是采用的运种方式，34ArgGLP-I(7-37)的合成有基因重组和固相偶联两种 方法，其中固相方法采用普通的保护氨基酸，偶联完成之后，将多肤从树脂上切割下来，就 可W得到34ArgGLP-I(7-37)。由于该序列上有很多的疏水性氨基酸，导致在固相合成过程 中容易形成0折叠而使得偶联尤其困难，很多氨基酸需要多次重复偶联，既不经济也容易 产生大量难去除的杂质。另外一种方法是在树脂上将整个利拉鲁肤的序列合成完，再将其 从树脂上切割下来就可W得到产品，例如CN102286092A介绍的是Alloc保护Lys侧链的方 法，在固相上将Alloc脱除然后偶联Glu和栋桐酸；CN102875665A仍然是WAlloc作为保 护基团，采用片段缩合的方法合成整条肤链；CN103275208A采用普通二肤片段取代单个 氨基酸来进行缩合，Lys的侧链采用ivDde保护的策略；由于运些方法都没有采用方法避免 产品合成过程中的缩聚问题，而且在整个合成中还要包括侧链的链接，所W仍然存在合成 困难的问题需要提高偶联时间并增加偶联次数，由此引起收率低，杂质多的状况，目前的运 些手段对于解决缩聚的作用有限，化学合成利拉鲁肤的想法仍然比较难W实现。
[0006] 0折叠（0-sheet)是多肤合成中常见的问题，多肤链上的幾基氧和肤链上的酷 胺氨相互缔合形成氨键，从P折叠结构上可W看出沿着肤链延伸的方向主链两侧存在大 量的氨键(结构1)。它们可W使肤链之间紧紧地聚集（aggregation)在一起，造成树脂缩 聚，树脂缩聚引起的后果就是偶联困难，偶联不完全，杂质增多，消旋成倍增加。对于疏水氨 基酸较多，序列比较长的多肤来说，缩聚尤为严重，影响了高纯度多肤的合成。
[0007] 对于利拉鲁肤来说，其序列中含有大量的疏水性氨基酸例如 Ala,Val,Phe,Trp,Ile等，运些氨基酸的存在使得利拉鲁肤从合成的中端就开始面临着严 重的缩聚问题。
[0008] 目前打破0折叠并避免缩聚最常用的思路是将肤链酷胺上的氨用其他官能团取 代，从而打破氨键缔合，由于肤链上的运种氨键被打破，就能很好的避免0折叠从而减少 缩聚，该官能团在最终的多肤切割过程中可W-起除去，而不会影响产品的结构。
[0009] CN103288951A选用的是伪脯氨酸二肤作为原料来合成多肤W避免缩聚，但是由于 伪脯氨酸二肤的价格很高，在工业上很难大量使用，同时其侧链连接也是在固相上完成，运 就使得最终很难得到高纯度的纯品多肤。
【发明内容】
[0010] 本专利的发明方法主要是为了解决多肤链缩聚严重引起副反应众多的问题。通过 运种方法可W解决利拉鲁肤合成过程中的严重的缩聚和消旋引起的反应收率低的问题，得 到的产品不仅收率高，而且杂质很少。
[0011] 为了解决运些问题，本发明提供的技术方案包括W下几个步骤： (1) 通过固相合成法依次偶联与利拉鲁肤主链相应的氨基酸，所述氨基酸均采用N端 Fmoc保护，部分或全部氨基酸的侧链予W保护，并且包含一种或多种W下形式的氨基酸： Fmoc- (Hmb)Gl}f-〇H、Fmoc- (Hmb)Ala-〇H、Fmoc- (Dmb)Gl}f-〇H和Fmoc- (Dmb)Ala-OH; (2) 将步骤（I)得到的多肤与固相载体切割并脱除所有侧链保护基，于液相中连接 Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu; (3) 脱除步骤（2)得到的产物的保护基，纯化得到利拉鲁肤。
[0012] 步骤（1)中的固相载体可W采用本领域常用的树脂；优选使用Wang树脂或者CTC 树脂，取代度在0.1-1. 5mol/g之间均可。本发明偶联过程中可W采用偶联剂。具体可W采 用DIC/H0Bt，DCC/H0Bt，DIC/H0At，DCC/H0At，PyB0P/DIPEA，EDCI/H0Bt/DIPEA，HATU/NMM, 皿TU/DIPEA,皿TU，PyA0P/NMM,BOPCl/DIPEA,B0P，A0P，PyB0P/H0Bt，DPPA/TEA，DECP, TSTU/NMM，TNTU/DIPEA,TDBTU/DIPEA,BEMT/DIPEA,邸P/NMM，CIP/NMM，CIB/NMM，CBM口/ NMM，B孤C/NMM,B0MI/NMM，HAP州/NMM,皿P州/NMM或者其中的任意组合。偶联剂的用量可 W在1-5个当量，优选3当量。在脱除Fmoc时，优选采用15-30%的赃晚/DMF，更优选20% 的赃晚/DMF。可W采用单次或者多次脱除的方式，除去Fmoc保护基团。本发明步骤（1)可 W获得一类多肤树脂，其结构为R-树脂，优选结构为R-Wang树脂或R-CTC树脂，其中R为 具有W下结构的多肤： (Hmb)Ala"GLP*-l,
其中GLP*-1代表的是其他氨基酸的侧链带有常规保护基团的GLP-1，该保护基团选用His(T;rt),Glu(0巧11),T虹（tBu),Ser(tBu),Asp(0巧11),Ser(tBu),TyrUBu),Gln(IYt), 和Arg(Pbf)。
[001引采用Hmb或者Dmb保护的Gly或者Ala的偶联条件仍然采用DIC/HOBt，DCC/ 册化，DIC/H0At，DCC/H0At，PyB0P/DI阳A,邸CI/HOBt/DIPEA，HATU/NMM,皿TU/DIPEA, 皿TU,PyAOP/NMM,B0PC1/DIPEA,BOP,A0P，PyB0P/H0Bt，DPPA/TEA,DECP,TSTU/ NMM，TNTU/DIPEA,TDBTU/DIPEA,CIP/NMM，CIB/NMM,CBMIT/NMM，B孤C/NMM，HAP州/NMM, 皿P州/NMM或者其中的任意组合。本发明的偶联反应优选在40°CW下进行。
[0014] 本发明还着重探讨了血b或者Dmb保护的氨基酸使用的个数极其所在的位置。优 选在AlaS,Glyin,Gly22,Ala"4,Ala25,Ala^,Gly35中的1-7个氨基酸上采用血b或者Dmb保护； 更优选在上述1-4个氨基酸上采用血b或者Dmb保护。！个Dmb或者血b的氨基酸能大大 改善多肤序列的缩聚，增加主链肤的收率，在将Dmb或者血b的氨基酸提高到两个后，能最 好地消除多肤的缩聚，序列上每个氨基酸的缩合都变得更为容易，偶联反应容易进行完全。 增加序列中Dmb或者血b保护的氨基酸的个数，位阻逐渐增加，偶联反应也逐渐变得困难。 从实验结果来看，比较好的证明了运一点，在i°Gly和25Ala上使用Dmb或者血b保护的替代 氨基酸，能够很好的解决多肤缩聚的问题。Dmb和血b保护的氨基酸具有等价的作用，没有 看到明显的差别。
[0015] 第（2)步中将多肤从固相载体上切割下来的切割液可W使用本领域常用的类 型。选择TFA作为切除成分，苯酪、纯水、乙二硫醇或茵香硫酸作为清除剂，避免副反应的 发生，TFA可W和任意清除剂做组合，其中优选组成为TFA、苯酪、纯水、乙二硫醇和茵香硫 酸，各组分的配比可W做一定的调整，优选其配比为TFA:苯酪：纯水：乙二硫醇：茵香硫酸 =87. 5:2. 5:2. 5:2. 5:5。该切割液除了能将多肤与固相树脂进行分离，还能够切除多肤侧链 的保护基W及血b或者Dmb。该切割过程的反应溫度为优选0-40度，更优选10-20度；反 应时间优选为0. 5-4小时，更优选1-2小时。
[0016] 偶联侧链的方法可W参考US6268343B1的工艺。本发明对US6268343B1进行了改 进，改进后化Imitoyl-Glu(OSu) -OtBu的用量为多肤的0. 8-8. 0倍，优选1. -1. 5倍，提高了 该项目的可操作性，极大的降低了原料的使用，减少了杂质的生成。
[0017] 侧链连接完成后，可W采用酸泽灭或者碱泽灭两个系列条件来泽灭反应，终止过 量的化Imitoyl-Glu(OSu)-化Bu产生的副反应。本发明优选使用盐酸，硫酸，憐酸，甲酸，乙 酸，硝酸，=氣乙酸，巧樣酸，氨氣酸，次氯酸，高氯酸，亚硫酸，氨漠酸，氨舰酸来泽灭反应， 运其中任何一种酸都在本发明的保护范围，在实际操作过程中，TFA是最优选。本发明优选 使用赃晚，苯胺，二异丙胺，盐酸径胺，乙二胺，丙二胺，甲胺，二甲胺，乙胺，节胺，丙胺，对甲 基节胺，下胺，环己胺，环戊胺，碳酸钢，碳酸钟，碳酸氨钢，氨氧化钟，氨氧化钢，氨氧化裡， 氨水作为碱来泽灭反应，其中赃晚是最优选条件。
[0018] 第（3)步中脱除侧链肤保护基可W使用本领域常用的脱保护试剂TFA与TIS或 者水分的任意配比，用于脱除簇基上的巧U。优选使用TFA:TIS:H20=95:2. 5:2. 5或者 TFA:H20=95:5。反应溫度优选0-40度，更优选5-15度，反应时间优选0. 5-4小时，更优选 1-2小时。
[0019] 说明书中及权利要求书中所设及到的英文缩写含义如下：
[0030] 下面通过具体实例，对本发明之前的内容作一些具体的阐述。
[0031] 本发明中，若无特指，所有的原料，试剂及仪器都是市面购得或者本领域常用。除 血b或者Dmb保护的氨基酸外，偶联的其余普通氨基酸的保护基分别为Fmoc-Gly-OH,Fmoc -Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-T;rp度OC)-册，Fm