磷酸肌酸类化合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，具体设及一种憐酸肌酸类化合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 憐酸肌酸是一种含有高能憐酸键化合物，在肌肉收缩的能量代谢中发挥重要作 用。它是屯、肌和骨骼肌的化学能量储备，并用于ATP的再合成。临床上采用肌肉注射或静 脉注射外源性憐酸肌酸二钢盐来治疗缺血状态下的屯、肌代谢异常，W及在屯、脏手术时将憐 酸肌酸二钢盐加入屯、脏停搏液中保护屯、肌。憐酸肌酸二钢盐作为屯、肌保护剂药品已经在国 内外已上市应用多年。
[0003] 目前外源性憐酸肌酸的制备方法有化学合成法、生物提取法和酶法。生物提取法 和酶法由于成本高、相对效率较低等原因，一定程度上限制了其应用。用化学合成法制备 憐酸肌酸是目前获得外源性憐酸肌酸的一个主要途径，其中W肌酢为原料合成憐酸肌酸的 方法（专利200710038838.讶是目前应用最广的方法之一。在W肌酢为原料生产憐酸肌酸 时，肌酢与=氯氧憐缩合反应过程中会有副反应，该副反应产物随后续工艺过程，最终形成 与憐酸肌酸钢极性近似的水溶性副产物，易于混到产品中影响终产品质量，目前对副反应 产物的检测未见有文献报道。
[0004] 憐酸肌酸目前在临床上最主要的用途，是制成注射用憐酸肌酸钢。注射剂相比其 它剂型，对产品的品质和安全性有更高的要求。对憐酸肌酸钢粗品及成品中因副反应产生 的杂质化合物进行检测，并对之在终产品中实现有效控制，有助于提高药品质量稳定性和 临床用药安全性。
【发明内容】
[0005] 本发明主要提供了一种憐酸肌酸类化合物及其应用，确定了憐酸肌酸钢粗品及终 产品中化合物Ia的具体结构，能加强对憐酸肌酸钢质量的有效控制。其技术方案如下：
[0006] 一种憐酸肌酸二钢盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，所述杂质化合物具 有如下式（Ia)所示的结构：
[0007]
[0008] W肌酢为原料生产憐酸肌酸钢，是当前主流的生产工艺之一。我们在质量提升研 究过程中，发现了化合物Ia,它是工艺过程中一个主要的副产物。该化合物的结构，从未见 过文献报道，推断经由W下的途径生成：
[0009]
[0010] 该化合物的理化性质和憐酸肌酸钢接近，易于混在终产品中影响产品质量，因此 有必要对粗品及终产品中的化合物Ia进行含量检测，控制该成分的含量W保证产品质量。
[0011] 具体检测条件及检测方法为： 阳〇1引检测条件如下
[0013]W十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相中W乙腊或甲醇为有机相、W缓冲盐 及离子对试剂的水溶液为水相，检测器为紫外检测器。
[0014] 其中，有机相与水相的体积比为0-40:60-100,优选的，为20:80。
[0015] 优选的，有机相为乙腊。
[0016] 优选的，水相中缓冲盐为憐酸二氨钢或憐酸二氨钟，离子对试剂为四下基氨氧化 锭或四下基漠化锭或十二烷基S甲基氯化锭，抑为4-8 ;更优选的，水相中缓冲盐含量为 0. %，离子对试剂含量为0.1 wt%，抑为6. 3-6. 8。
[0017] 紫外检测波长为210皿。 引检测方法：
[0019] 对照品：Wla、扣、Ic或Id为对照品，扣、1C、Id具有式（I)所示的结构通式：
[0020]
阳02U 其中，Ml选自化和K中的任一种，M2选自化、K和H中的任一种对于扣，Ml为 化，M2为H;对于Ic,Ml为K，M2为K;对于Id,Ml为K，M2为H;
[0022]la、扣、Ic和Id的制备方法如下： 阳02引 （I)Ia的制备
[0024] 富集副产物的憐酸肌酸二钢盐粗品，加甲醇超声处理两次，倾去上层，沉淀加水 使溶解，再加入甲醇或乙醇，揽拌均匀，过滤，滤液于0~10°c放置结晶，再用水-甲醇或 水-乙醇重结晶一次，滤出，干燥，即可得化合物Ia纯品，纯度大于98% ; 阳0巧](2)扣的制备
[0026]取化合物Ia加水溶解，用IM肥1调PH至3~4,加入乙醇揽，抽滤，即得化合物 扣；
[0027] (3)Ic的制备
[0028] 将由肌酢和=氯氧憐缩合反应得到的肌酢憐酷氯，边揽拌边缓慢加入到质量浓度 为20 %的KOH溶液中，揽拌过夜，用盐酸调PH至7~8,揽拌下加入溶液体积4倍量的乙 醇，静置数小时后，抽滤，得到憐酸肌酸钟粗品，富集副产物后，加甲醇超声处理两次，倾去 上层，沉淀加水使溶解，再加入甲醇或乙醇，揽拌均匀，过滤，滤液于0~l〇°C放置结晶，再 用水-甲醇或水-乙醇重结晶一次，滤出，干燥，即得到化合物Ic纯品；
[0029] (4)Id的制备
[0030] 取化合物Ic加水溶解，用IM肥1调PH至3~4,加入乙醇揽拌，抽滤，即得化合物 Ido
[0031] 具体检测方法一： 阳03引取la、扣、Ic或Id纯品，溶解于流动相中，分别制成50yg/ml的对照液1和5yg/ml的对照液2 ;取待测样品溶解于流动相中，配制成5mg/ml的待测液；待测液为憐酸肌酸 钢粗品时使用对照液1，分别吸取20y1的对照液1和待测液注入液相色谱仪，测定憐酸肌 酸钢粗品中Ia的含量；待测液为憐酸肌酸钢精制品时使用对照液2,分别吸取20y1的对 照液2和待测液注入液相色谱仪，测定憐酸肌酸钢精制品中Ia的含量。
[0033] 具体检测方法二：
[0034] 参考专利201310227572. 9用离子色谱法，电导检测器来测定。使用阴离子交换色 谱柱，W氨氧化钟溶液为流动相，流速为每分钟0. 5~1. 5ml，电导检测器，抑制电流80~ 100mA，柱溫 15 ~35°C。
[0035] 对照品溶液制备：取化合物la、Ib、Ic或Id纯品适量，精密称定，用纯化水分别制 成每Iml含20yg的溶液[对照品溶液1]和每Iml含2. 0yg的溶液[对照品溶液2]，即 得（浓度均按无水物计算）。
[0036] 供试品溶液的制备：精密称取憐酸肌酸钢相关样品适量，用纯化水溶解并配成 2mg/ml的溶液，即得。
[0037] 测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各25y1，注入离子色谱仪，测定， 即得。测定憐酸肌酸钢粗品时使用对照品溶液1，测定憐酸肌酸钢精制品时使用对照品溶液 2。
[0038] 上述憐酸肌酸类化合物在憐酸肌酸钢质量控制中能够发挥应用作用。
[0039] 采用上述憐酸肌酸二钢盐中杂质化合物的高效液相色谱检测方法，本发明具有W 下优点：
[0040] 新发现了W肌酢为原料生产憐酸肌酸钢的主要副产物即化合物Ia,并制备了类似 化合物扣、Ic和Id,并W之来控制易于进入终产品的化合物Ia的含量，能加强对憐酸肌酸 钢质量的有效控制，有助于提高临床用药的安全性和有效性；
[0041] 本发明提供了一种检测憐酸肌酸钢副产物杂质Ia的高效液相检测方法，来控制 粗品及终产品中化合物Ia的含量，能加强对憐酸肌酸钢质量的有效控制，有助于提高临床 用药的安全性和有效性。
【附图说明】
[0042] 图I和图2为化合物Ia的结构图；
[0043] 图3为测定憐酸肌酸钢粗品中杂质Ia的HPLC色谱图； W44] 图4为测定憐酸肌酸钢精制品中杂质Ia的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0045] 具体实施例 阳046] 实施例1
[0047] 化合物Ia的制备
[0048] 取经富集副产物的憐酸肌酸钢粗品60g，加入200ml甲醇超声约5min，放置，倾去 上层液体，沉淀再同样处理一次，倾去上层液体，沉淀加入HOml水使溶解，再加入420ml甲 醇，揽拌均匀，过滤，滤液于l〇°C放置结晶，次日过滤，得晶体11.Og,加30ml水和100mL甲 醇重结晶一次，滤出晶体，室溫鼓风干燥2小时，得到7.6克，用实施例8中的HPLC方法检 测纯度，纯度为98. 6% (面积归一法）。 W49] 实施例2
[0050] 化合物Ia的结构确证 阳05U 样品来源；
[0052] 实施例1得到的化合物Ia纯品。X衍射测试所用的单晶来自实施例1重结晶过程 中挑选出的单晶。 阳05引测试内容：
[0054]IHNMR;31PNMR;ESI质谱；ESI高分辨质谱；X单晶衍射；卡尔一费休氏法测定水 分。 阳〇55] 测试结果：
[0056] A:?NMR值2〇, 400M)，5 3. 82 (2H,S,邸2)，2. 82 (3H,S,邸3)。
[0057] B:3中NMRa)2〇, 400M)，5 -0. 15, 5 -9. 69,（未用憐酸做参比），两单峰积分比例为 1:1。
[0058]C:ESI质谱（正离子），出现361. 8[M+Na]+离子峰和700. 8巧M+Na] +离子峰。
[0059] D:ESI(正离子）高分辨质谱。 I；0060] 表1结果
[0061]
[0062] E:X单晶衍射结果显示的结构，见图1和图2,单晶晶体数据见表2所示：
[0063] 表2化合物Ia的8水合物单晶的晶体数据
[0064]
W65]F:卡尔-费休氏法测定水分结果：30. 06%。
[0066] 解析：?NMR谱中显示邸2[S3. 82, 2个H,单峰]和邸3[S2. 82, 3个H,单峰]的 信号，其化学位移值与憐酸肌酸中相应的化学位移值接近，表明含有肌酸或肌酢结构片段。 憐谱中，显示两个1 :1的单峰，表明含有两个化学环境不同的憐酸根基团。ESI质谱显示了 分子加钢离子峰及相应2倍离子峰，ESI高分辨质谱显示的分子式与X单晶衍射得到的结 果完全相符。X单晶衍射显示含8个结晶水，含8个结晶水时，水分含量理论值为29. 81 %， 运与卡尔-费休氏法测定水分的结果非常接近，，两者结果能相互印证。因此化合物Ia的 8水合物的立体结构为如图1、图2所示。
[0067] 实施例3
[0068] 化合物Ia的不同干燥条件与结晶水含量
[0069] 取实施例1中得到的晶体2份，每份0.5克，精密称定后，按照下面的方法进行干 燥：1、40°C鼓风干燥3小时；2、60°C鼓风干燥2小时。于干燥器中冷却至室溫后，精密称定 重量，按照实施例8中的HPLC条件测定纯度，计算失重及干燥后结晶水含量n。结果如下 表： 阳070] 表3化合物Ia的结晶水含量
[0071]
阳072] 实施例4 阳07引化合物扣的制备 阳074] 取化合物Ia0. 5克，加入2ml水溶解，用IM肥1调PH至3~4,加入IOml乙醇， 揽拌1小时，抽滤，得化合物Ib，40°C鼓风干燥3小时，得0. 45克。 阳〇7引用实施例8中的HPLC方法检测纯度，98. 7 % (面积归一法）。ESI质谱（正离 子）：340. 3[M+Na]\卡尔-费休氏法测定水分：10. 94%。
[0076]实施例5阳077] 化合物Ic的制备
[0078] 将由肌酢和=氯氧憐缩合反应得到的肌酢憐酷氯，在揽拌下缓慢加入到体积浓度 20%KOH溶液中，揽拌过夜，用盐酸调PH7~8,揽拌下加入溶液体积4倍量的乙醇，静置数 小时后，抽滤，得到憐酸肌酸钟粗品，富集副产物后，再用与实施例1中相似的方法处理，得 到化合物Ic纯品。
[0079] 用实施例8中的HPLC方法检测纯度，99. 1 % (面积归一法）。ESI质谱（正离 子）：410. 5[M+Na]\卡尔-费休氏法测定水分：16. 21%。
[0080] 实施例6
[0081] 化合物Id的制备 阳0間取化合物Ic0. 5克，加入2ml水溶解，用IM肥1调PH至3