一种快速制备鱼类pcr模板dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR)是上世纪80年代中期发展起 来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好和易自动化等特点，目前 已成为生物学研究领域不可或缺的研究方法。在水产鱼类生物学研究中，PCR方法是进行 核酸检测的首选方法。在进行PCR之前，需要有一条含有目的基因片段的DNA链作为模板。
[0003] 目前，鱼类模板DNA的提取操作较为复杂，操作过程中对温度控制要求较高，人工 劳动强度较大，不便推广使用。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板 DNA的方法。
[0005] 本发明所采用的技术方案为，一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，包括以下步 骤：
[0006] 1)样本预处理：将鱼卵或仔鱼捣碎；
[0007] 2)加裂解液：向体系中加入DNA裂解液；
[0008] 3)消化：将整个体系依次在53~57°C消化80~100min，93~97°C变性3~8min， 4~8°C保持3~8min。
[0009] 在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在_20°C冷藏即可。
[0010] 在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可 使用。
[0011] 优选的，所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、lmmol/L的EDTA、质 量分数为〇. 5%的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水。本发明中，所述裂解液的pH值为8.0。
[0012] 当然，裂解液的组成配方不局限于这一种，本行业技术人员可根据现有技术，选择 合适的、不同组成的裂解液。同时，对于消化温度和时间的设置，因为都属于现有技术，本行 业技术人员可以轻易得到和调整，在此就不再赘述。
[0013] 优选的，在所述步骤1)样本预处理前，还包括样本的固定：将所述样本浸泡于无 水乙醇中，在-20~25°C下保藏待用。使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降 解，利于后续DNA的提取流程。
[0014] 进一步的，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:5~1:10。根据不同的鱼类样 本，可调整不同的体积比以满足后续提取流程，当然，绝大多数样本和无水乙醇的最适体积 比均落于1:5~1:10之内。
[0015] 需要说明的是，在所述样本的固定和所述步骤1)之间，还包括固定液的去除：将 所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；除去固定 液是为了避免无水乙醇对后续提取流程的影响。
[0016] 为了在PCR模板DNA提取的过程中，精确、简单的控制温度，本发明创造性的在3) 消化过程中，使用PCR仪进行温度控制。也就是说，使用PCR板作为样本的承载物，且在向 PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜密封，在PCR仪内进行3)消化。
[0017] 需要说明的是，PCR板每一个孔中，所述样本的数目一般情况下是一个，也就是说， 只使用单个鱼卵或是单尾仔鱼，采用一个样本的设置，最终得到的PCR模板DNA也是一套， 不会出现某个DNA链基因重复出现的情况。对应单个鱼卵或是单尾仔鱼，裂解液的量为 50 ~100μL。
[0018] PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用传统的水浴控温手段，简化了操作强 度的同时，提高了提取过程中的精度。
[0019] 优选的，在3)消化完成之后，还包括PCR模板DNA的检测。所述检测为：使用所述 PCR模板DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增结果进行电泳分析。本发明直接使用PCR扩增 技术对所述PCR模板DNA进行检测，在一般的实验条件下，直接考量PCR扩增得到的目的基 因，根据目的基因的数目和均一度，判断所述PCR模板DNA的提取是否成功。
[0020] 进一步的，所述PCR扩增反应程序为：94°C预变性3min;然后25个循环，每个循环 包括94°(：变性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8;25个循环完毕后，最后72°(：延伸1〇1^11。 作为本技术领域的常用选择，所述电泳分析为8 %聚丙烯凝胶电泳检测。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 1、本发明使用PCR仪进行温度控制，PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用 传统的水浴控温手段，简化了操作强度的同时，提高了提取过程中的精度。
[0023] 2、本发明操作流程简单，步骤少，提取速度快，具有快速简洁的优点。
[0024] 3、使用本发明在提取所述PCR模板DNA前，使用无水乙醇进行固定，保证最终成品 保存完整，DNA较少降解，质量较高。
【附图说明】
[0025] 图1是对使用微卫星标记P〇25A作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电泳检测 图；
[0026] 图2是对使用微卫星标记Poli9-8tuf作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电 泳检测图；
[0027] 图3是对使用微卫星标记Polil3tuf作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电泳 检测图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。
[0029] 实施例1
[0030] 本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，在本实施例中，使用牙鲆鱼 卵进行PCR模板DNA的提取。本实施例中，使用的鱼卵为处于原肠期的牙鲆受精卵，所述方 法包括以下步骤：
[0031] 1)样本的固定：采集牙鲆鱼卵作为样本，将所述样本浸泡于无水乙醇中，所述样 本与所述无水乙醇的体积比为1:5,在-20Γ下保藏待用；使用无水乙醇可保证DNA分子在 一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
[0032] 2)固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保 无水乙醇去除干净；
[0033] 3)样本预处理：用灭菌的枪头将样本捣碎，放于PCR板中，PCR板每一个孔中只放 置一个鱼卵；本实施例使用的是96孔的PCR板，也就是一共放置96个鱼卵，当然，根据实验 的需要，可调整更换使用其他规格的PCR板。
[0034] 4)加裂解液：每一个孔中加入50 μ L DNA裂解液，加裂解液时在PCR板的孔中对 所述枪头进行冲洗，确保所述枪头上无残留鱼卵。所述裂解液的成分及含量如下：10_〇1/ L的Tris-Cl、lmmol/L的EDTA、质量分数为0· 5%的SDS、20mg/mL的Proteinase Κ，余量为 纯水；
[0035] 5)消化：在向所述PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜将所述PCR板 密封，将密封过得PCR板置于PCR仪中，在PCR仪上设置温度控制程序，依次在53°C消化 80min，93°C变性3min，4°C保持3min即可完成消化，在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板 DNA，在-20°C冷藏即可。
[0036] 在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可 使用。
[0037] 实施例2
[0038] 本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，在本实施例中，使用牙鲆鱼 卵进行PCR模板DNA的提取。本实施例中，使用的鱼卵为处于出膜期的牙鲆受精卵，所述方 法包括以下步骤：
[0039] 1)样本的固定：采集牙鲆鱼卵作为样本，将所述样本浸泡于无水乙醇中，所述样 本与所述无水乙醇的体积比为1:7,在0°C下保藏待用；使用无水乙醇可保证DNA分子在一 定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
[0040] 2)固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保 无水乙醇去除干净；
[0041] 3)样本预处理：用灭菌的枪头将样本捣碎，放于PCR板中，PCR板每一个孔中只放 置一个鱼卵；本实施例使用的是96孔的PCR板，也就是一共放置96个鱼卵，当然，根据实验 的需要，可调整更换使用其他规格的PCR板。
[0042] 4)加裂解液：加入75 μ L DNA裂解液，加裂解液时在PCR板的孔中对所述枪头进行 冲洗，确保所述枪头上