一种基于荧光共振能量转移技术的阿尔法1b受体筛选模型的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用细胞稳定转染技术，构建了肾上腺素α1,受体括抗 剂药物的筛选模型，用于待测样品对αle的括抗作用的高通量检测。
【背景技术】
[0002] α1肾上腺素受体（Ai-a化enoc巧tor,α1-AR)属于G蛋白偶联膜表面受体，广泛分 布于血管平滑肌、脂肪、肝、肺、子宫、屯、肌等机体的各种器官、组织和细胞，并介导多种生理 效应，在调节代谢和屯、血管、神经、消化、生殖、内分泌等系统的生理活动和病理改变等方面 有重要的作用，因而受到广泛重视。根据国际药理联合会受体命名与药物分类委员会规定， 将日1受体分为α1Α、α1Β、α1D3种亚型。
[0003]ΒΡΗ为一种常见的老年病，发病率极高，常导致患者排尿困难、残尿、尿急、尿频、血 尿、夜尿等，其主要治疗方法有手术法和药物疗法。近年来，有研究表明切除前列腺的患者 常会发生性功能障碍等副作用，寻求安全有效的药物治疗方法对治疗前列腺增生具有重要 意义。α1肾上腺素受体括抗剂能够减轻括约肌紧张程度和前列腺增生程度从而缓解症状， 是目前公认的治疗ΒΡΗ及由其引起的下尿路症状（LUTS)的首选药物。
[0004] 在中国人的前列腺组织中，αU-AR的百分含量为30%，αle-AR为45%，α1D-AR为 25%。目前临床上应用的受体括抗剂，如赃挫嗦、多沙挫嗦等药物对α1受体亚型缺乏 选择性，由于受体的广泛分布和重要生理功能，使用α1受体括抗剂常会出现体位性低 血压、头晕、无力等副作用。其不良反应主要是由于括抗《le受体后产生，故通过检测药物 对αle的括抗作用来考察在治疗过程中是否产生不良反应。
[0005]本实验通过建立肾上腺素αle受体括抗剂药物筛选模型，为有效控药物在治疗前 列腺增生中产生的不良反应具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于建立一种肾上腺素αle受体括抗剂高通量筛选模型，具有信噪 比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0007] 本发明的技术方案：
[000引本发明利用稳转细胞株的方法建立了一种肾上腺素α1沒体括抗剂高通量筛选 模型。
[0009]步骤一：αle受体括抗剂筛选模型的建立与优化。
[0010] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0011] 步骤Ξ:高通量筛选模型验证。
【附图说明】：
[001引 图1:IP1标准稀释液在Paradigm中的读值。（η= 3，化S.)
[001引图2:陆enyl巧虹ine作用不同细胞数所产生量效曲线EC5。的比较。（η= 3, ；±s.)
[0014] 图3:肥AThy化ochloride括抗甜0/日IB稳转细胞产生的量效曲线。（η= 3,；成）
【具体实施方式】
[0015] W下结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0016] -、αle受体括抗剂筛选模型的建立
[0017] 1、实验材料
[0018] C册/α1B细胞株、F12、10%FBS、400μg/mLG418、StimulationBuffer(SB)、C02 培养箱、384 孔板、Paradigm?DetectionPlatform。
[001引 2、实验步骤
[0020] (1)细胞培养
[0021] 1)Τ25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到对数生长期。
[0022] 2)将贴壁细胞经邸ΤΑ消化、离屯、后重悬，对细胞计数。
[0023] 3)用培养基稀释细胞悬液，使细胞密度达到7. 5Χl〇5cells/mL，将此细胞悬液移 入T25培养瓶中，在37°C/5 %C〇2环境下培养细胞。
[0024]4)用于确定细胞数、验证阳性药及筛选α1D括抗剂试验的CH0/αle细胞应是复苏 后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前将其用PBS润洗细胞一次，接着用 0. 5mM邸TA消化，离屯、，去除上层液体，最后将细胞用适量SB重悬至所需细胞密度。
[00巧](2)标准曲线的测定及最佳细胞数确定
[0026] 1)配制IP-one标准稀释液：P1标准溶液（试剂盒自带）逐级稀释为最终浓度的 2倍。
[0027] 2)配制激动剂去氧肾上腺素〇%en^巧虹ine)梯度稀释液：用α激动剂去氧肾 上腺素刺激细胞产生ΙΡ1，根据最终拟合曲线得到的ECs。和窗口值确定最佳细胞数。（见图 U2)
[002引 3)配制不同浓度的细胞稀释液：用IP1StimulationBuffer将（1). 4)中重悬好 的细胞分别稀释为 5000cells/μl^、2500cells/μL及 1250cells/μL。
[002引 4)加样：a:将似.1)中稀释好的IPl溶液加入384白板中，每孔10μ1，S个复 孔；b:将（2). 2)中稀释好的去氧肾上腺素溶液按每个浓度3个复孔，5μ1每孔加入384孔 板中，接着向其中分别加入（2). 3)配制好的不同浓度的细胞稀释液5μ1。此时标准曲线和 反应孔反应体积均为10μ1。将TopSeal-A膜贴于板面并37°C解育比。
[0030] 5)终止试剂：用Lysisbuffer(LB)将IPl-d2 及anti-IPl稀释 33 倍，按 1 : 1 混 匀平衡室溫后加入各孔，每孔10μL。将384孔板在50化pm下离屯、5s，使20μL试剂混合 均匀W充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室溫下继续解育比。
[003。 6)检测：解育时间到达后，掲去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? DetectionPlat化rm上检测。处理数据，确定最佳细胞数和激动剂去氧肾上腺素的ECs。和ECso。（见图。
[00础 做括抗剂验证
[003引 1)配制α1B括抗剂肥AThy化ochloride梯度稀释液：括抗剂肥AT hy化ochloride母液浓度为lOOmM，用IP1StimulationBuffer逐级稀释为终浓度的3倍。
[0034] 2)配制含最佳细胞数的溶液：用SB将（1). 4)中重悬好的细胞稀释为（2).6)中 得到的最佳细胞浓度。（见图2)
[003引 3)加样：将（3). 1)中稀释好的肥AThy化ochloride溶液按每个浓度3个复孔， 2. 5μL每孔加入384孔板中。将做.。配制的细胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。将 384孔板在50化pm下离屯、5s，使7. 5μL试剂混合均匀W充分反应。为防止试剂蒸发造成 损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室溫下使之解育15min。
[003引 4)将去氧肾上腺素母液稀释成似.6)中测定的ECs。，每孔2. 5μ1加入对应的含 肥AThy化ochloride的384孔板中。将384孔板在500巧m下离屯、5s，使10μL试剂混合均 匀W充分反应。为防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37°C/5% C02下使之解育45min。
[0037] 5)按似.5)配制终止试剂。向每孔加入ΙΟμΙIPl-d2/anti-IPl溶液（1 : 1)。 将384孔板在50化pm下离屯、5s，使20μL试剂混合均匀W充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室溫下继续解育比。
[003引 6)解育时间到达后，掲去TopSeal-A膜，将板放于设定好程序的Paradigm? DetectionPlat化rm上检测。处理数据，确定括抗剂的IC5。。（见图3)
[00測二、数据处理
[0040] 1、根据最终拟合曲线得到的ECs。和窗口值确定最佳细胞数。
[0041] 2、根据肥AThy化ochloride括抗CHO/a稳转细胞产生的量效曲线，确定括抗剂 的 1〔5。。
[0042] 实验结果
[0043]确定稳转细胞株肾上腺素αU受体括抗剂药物筛选模型构建条件，每孔细胞数为 5000cells/μ1，即25000cells/well时，所得到激动剂ECg。与报道值最接近且窗口值最大。 (见图1、2)通过该模型验证了激动剂去氧肾上腺素对稳转细胞株αle受体的激动作用，其 ECw为2.ΙμΜ。同时验证了括抗剂塔索罗辛对稳转细胞株αle受体的括抗作用，其ICw为 9. 2nM。（见图 3)。
【主权项】
1. 肾上腺素α1B受体拮抗剂药物筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) α1B受体拮抗剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于T25中培养的细胞贴壁度要达到80%，达到 对数生长期，细胞密度为7. 5X105cells/mL。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于用于确定细胞数、验证阳性药及筛选a1D拮 抗剂试验的CHO/α1B细胞应是复苏后至少传代3次且达到稳定生长状态的细胞。于实验前 将其用PBS润洗细胞一次，接着用0. 5mMEDTA消化，离心，去除上层液体，最后将细胞用适 量SB重悬至所需细胞密度。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于配置IP-one标准稀释液、激动剂去氧肾上 腺素（Phenylephrine)梯度稀释液需按照给定浓度配置，细胞分别稀释为5000cells/μL、 2500cells/yL及 1250cells/yL。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于加样方法：a:将配置好的IP1标准稀释液加 入384白板中，每孔10μ1，三个复孔；b:将稀释好的去氧肾上腺素溶液按每个浓度3个复 孔，5μ1每孔加入384孔板中，接着向其中分别加入配制好的不同浓度的细胞稀释液5μ1。 此时标准曲线和反应孔反应体积均为10μ1。将TopSeal-A膜贴于板面并37°C孵育lh。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于终止试剂配置：用Lysisbuffer(LB)将 IPl-d2及anti-IPl稀释33倍，按1 : 1混匀平衡室温后加入各孔，每孔10yL。将384孔 板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反应。重新贴上TopSeal-A膜并将板 放于室温下继续孵育lh。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于配制α1B诘抗剂HEAThydrochloride梯度稀 释液方法为：诘抗剂HEAThydrochloride母液浓度为 100mM，用IP1StimulationBuffer 逐级稀释为终浓度的3倍。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于加样方法：将稀释好的HEAThydrochloride 溶液按每个浓度3个复孔，2. 5μL每孔加入384孔板中。将配制的细胞溶液按每孔5μL加 入384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使7. 5μL试剂混合均匀以充分反应。为防止 试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于室温下使之孵育15min。将去氧肾 上腺素母液稀释成步骤（2)中测定的ECS。，每孔2. 5μ1加入对应的含HEAThydrochloride 的384孔板中。将384孔板在500rpm下离心5s，使10μL试剂混合均匀以充分反应。为 防止试剂蒸发造成损失，将TopSeal-A膜贴于板面并将板放于37°C/5 %C02下使之孵育 45min〇9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于配制终止试剂。向每孔加入10yLIPl-d2/ anti-IPl溶液（1 : 1)。将384孔板在500rpm下离心5s，使20μL试剂混合均匀以充分反 应。重新贴上TopSeal-A膜并将板放于室温下继续孵育lh。10. 权利要求1-10中所述任一所述的方法在筛选肾上腺素a1B受体拮抗剂药物的应 用。
【专利摘要】利用稳转细胞株技术，构建肾上腺素α1B受体拮抗剂药物的筛选模型，验证了激动剂去氧肾上腺素对稳转细胞株α1B受体的激动作用，以及拮抗剂塔索罗辛对稳转细胞株α1B受体的拮抗作用，实现待测样品对α1B的拮抗作用的高通量检测，为有效控药物在治疗前列腺增生中产生的不良反应具有重要意义。具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105255991
【申请号】CN201510828138
【发明人】严明, 何玲, 张陆勇
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月20日