Tyms基因表达量荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
【专利说明】TYMS基因表达量黄光定量PCR检测试剂盒及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种类胸巧酸合成酶Crhymic^datesynthase,TYM巧基因巧光定量 PCR检测试剂盒及其应用。 (二）【背景技术】
[0002] 类胸巧酸合成酶（Thymid}datesynthase,TYIVB)基因定位于18pll. 32,全长 16肺，含7个外显子。TYMS表达产物为胸巧酸合成酶灯巧，TS为两个相同单位组成的二聚 体蛋白质，每个亚单位的分子量是36kDa。胸巧酸合酶广泛存在于人体的细胞质中，主要功 能是结合5,10-2亚甲基四氨叶酸（C肥即4)，催化脱氧尿巧酸度UMP)甲基化为脱氧胸巧酸 (dTMP)，是dTMP从头合成的限速酶，而dTMP是核酸生物合成所必需的，是细胞内胸巧的唯 一来源，抑制TS活性便可抑制肿瘤细胞的增殖。
[0003] 对56例NSCLC术后组织标本进行免疫组化及RI-PCR测定发现，在癌组织中TS蛋 白总阳性率为56%，临床病理特征分析后发现TS蛋白及基因在鱗癌中表达水平显著高于 腺癌，差异具有统计学义，同时研究发现TS表达与分化程度亦密切相关（P<0. 05)。对培美 曲赛和多西他赛二线治疗NSCLC头对头的III期随机研究进行的回顾性分析发现，在对鱗 癌的患者培美综述曲赛和多西他赛的中位生存分别为6. 2个月，7. 4个月（P= 0. 018)，多 西他赛好于培美曲赛；在对非鱗癌的患者，培美曲赛和多西他赛的中位生存分别为9. 3个 月和8. 0个月（P= 0. 048)，培美曲赛好于多西他赛；此研究显示可能正是鱗癌中TS的过 表达降低了其对抗叶酸药物的敏感性。采用免疫组化及化qManRTPCR法检测非小细胞肺 癌患者癌组织及癌旁正常组织中TS蛋白和基因的表达情况发现，TS蛋白及基因在癌组织 中均呈高表达，且TS蛋白及TS基因具有密切相关性。RTPCR扩增TSmRNA时得到两种不 同DNA片段，分别为Ξ倍重复（3R)和双倍重复（2R)型等位基因，其中具有3R/3R基因型的 癌组织中TS表达水平显著高于其它基因型。由上可知，TS表达水平对评估NS化C的生物 学特性有重要作用，TS可能是预测NSCLC预后的潜在的重要分子标志物。现有的证据己 经向我们掲示了TS作为未来NSCLC个体化治疗的重要的分子标志物的潜力。 (Ξ)
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种人TYMS基因巧光定量PCR检测试剂盒，用于检测人TYMS 基因的表达，特异性好，灵敏度高。 阳0化]本发明采用的技术方案是：
[0006] 一种检测人TYMS基因突变的巧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反 应试剂；所述特异性引物序列如下：
[0007] 上游引物：5 ' -ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3，
[0008] 下游引物：5 ' -AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3 '。
[0009] 所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓冲液、PCR缓冲 液、Mg2\双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用市售PCRMix成品。
[0010] 所述试剂盒还可包括人TYMS基因检测标准品，所述标准品序列如下：
阳01引 t不准品的制备：WGenebank中发布的人TYMS的基因序列为柄；准，W健康体检人 的外周血mRNA为模板，反转录为cDNA。W该cDNA为模板，用上述引物扩增出特异性的PCR片段，然后把该PCR片段插入到T载体中，利用大肠杆菌D册α菌株转化并提取质粒， nano化ορ2000测定浓度和纯度，W此质粒作为检测分析中的标准品。
[0013] 本发明还设及所述的试剂盒在检测人TYMS基因表达量中的应用。
[0014] 具体的，所述应用方法如下：
[0015] (1)采集待测样本，提取RNA;样本可W是血液、穿刺组织、石蜡组织、手术切除组 织等；
[0016] (2)W样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA;
[0017] 反转录反应：RNA模板0.lug,反转录反应试剂（promega试剂盒），双蒸水；反转录 反应：25°C15min;50°CIhour;85°C5min;4°C，5min。
[0018] (3)W梯度浓度的人TYMS基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反 应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线；
[0019] (4)W样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体 系，进行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得TYMS基因表达量。可W样品cDNA为模板，加 入内参 18s特异性引物（F:5，-AGAAACGGCTACCACATCCA-3，;R:5，-CACCAGACTTGCCCTCCA-3，） 和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，监控实验体系的可行性。
[0020] 所述PCR反应条件如下：95°C预变性2min;95°C变性15s、60°C退火20s、72°C延伸 20s(此处收集巧光信号），40个循环。
[0021] 本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TYMS基因表达量，特异 性好，灵敏度高，具有较好应用前景。 (四）
【附图说明】
[0022] 图1为标准曲线及3对（癌组织和癌旁组织）临床样本的检测结果；
[0023] 图2为内参18s的扩增曲线。 (五）
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此： 阳02引实施例1 : 阳0%] (1)样品准备：取患者手术切除组织，提取RNA(浓度不小于l(K)ng，A260/280不小 于 1. 9)。
[0027] (2)样品处理：取lOOng的RNA，加入反转录试剂（promega试剂盒）5μ1，补双蒸 水到20μ1，按如下条件进行反转录反应：25°C15分钟；50°C1小时；85°C5分钟；4°C，5分 钟。 阳ο測 （3)巧光定量PCR反应：
[0029] 利用（2)中反转录产物为模板进行：取上述反转录模板5μ1，加入0.1ml的8联 排管中（含巧光定量PCR反应试剂15μ1)。同时在标准管中（含巧光定量PCR反应试剂 15μ1)加入相应梯度浓度的标准品；在内参管（含巧光定量PCR反应试剂15μ1，引物为内 参18s特异性引物）中加入5μ1上述cDNA模板。混匀。然后加入巧光定量反应引物，上 机检测。在ABISt巧化ePlus仪器上，选择标准曲线法和SYBR染料，进行PCR反应；
[0030] 巧光定量PCR反应试剂组成如下：总体积：15μ1;PCRMix值BIBioscience) (10μ1)引物集（0. 2μ1)，双蒸水（4. 8μ1);
[0031] ?〇?反应条件如下：95°(：预变性2111111;95°(：变性153、60°(：退火203、72°(：延伸 20s(此处收集巧光信号），40个循环。
[0032] (4)结果判读。根据标准品建立标准曲线，利用待测样品的Ct值，从该曲线上读取 相应的TYMS基因表达量，结果参见图1，内参18s的扩增曲线参见图2 ;由图可见：本发明试 剂盒可用于检测人TYMS基因表达量，特异性好，灵敏度高。
【主权项】
1. 检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试 剂；其特征在于所述特异性引物序列如下： 上游引物：5' -ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3' 下游引物：5' -AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3'。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括人TYMS基因检测标准 品，所述标准品序列如下： 5'-ATCTTCCTCTGATGGCGCTGCCTCCATGCCATGCCCTCTGCCAGTTCTATGTGGTGAACAGTGAGCTG TCCTGCCAGCTGTACCAGAGATCGGGAGACATGGGCCTCGGTGTGCCTTTCAACATCGCCAGCTACGCCCTGCTCA CGTACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGAAGCCAGGTGACTTTATACACACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTG AATCACATCGAGCCACTGAAAATTCAGCTTCAGCGAGAACCCAGACCTTT-3 ' 〇3. 权利要求1所述的试剂盒在检测人TYMS基因表达量中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用方法如下： (1) 采集待测样本，提取RNA; (2) 以样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA; (3) 以梯度浓度的人TYMS基因检测标准品为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试 剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘制标准曲线； (4) 以样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进 行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，获得TYMS基因表达量。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述PCR反应条件如下：95°C预变性2min; 95°C变性15s、60°C退火20s、72°C延伸20s，40个循环。
【专利摘要】本发明涉及一种检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：上游引物：5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3’下游引物：5’-AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3’。本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TYMS基因表达量，特异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105255865
【申请号】CN201510671928
【发明人】刘小龙, 张云, 杨诚, 高运臻, 李雨阳
【申请人】苏州贝斯麦医疗仪器有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月16日