羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] β防御素104a是一种在羊附睾头高度特异性表达的防御素，需要有特定的抗体 研究其蛋白的表达定位特点及其生物学功能，然而，目前还未见有可用于绵羊和山羊的β 防御素l〇4a多克隆抗体。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备 方法和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0005] 羊抗兔β防御素104a多克隆抗体，它的核苷酸序列为
[0006] TGTTTGAAAAGGTGGAATGTCAACTCACTGAATCCTCAGAAGGAC
[0007] 本发明还提供了上述羊抗兔β防御素104a多克隆抗体制备方法，包括如下步 骤：
[0008] S1、将β防御素104a蛋白N端55-69共15个氨基酸作为羊抗兔β防御素104a 多克隆抗体的抗原表位，合成羊β防御素l〇4a多肽，纯度>75%。
[0009]S2、取步骤S1所得的1.5mg β防御素104a多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备 用；
[0010] S3、采用AbMax标准程序（42天），使用免疫原KLH-CLKRWNVNSLNPQKD多肽免疫兔 子，采用步骤S2所得的免疫原进行若干次加强免疫，多肽-BSA的多抗效价达到标准：血清 滴度多1 : 50000,第28天每只放血20ml并加强免疫，若动物无异常情况，则在第42天终 放血，得羊抗兔β防御素104a多克隆抗体。
[0011] 其中，所述抗原表位的氨基酸序列为CLKRWNVNSLNPQKD。
[0012] 上述抗体可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和Western Blotting检测，用于免疫组织化学时浓度为1 : 100-500;用于细胞免疫荧光化学时，浓度 为 1 : 50-200;用于Westernblotting时，浓度为 1 : 500-1000。
【具体实施方式】
[0013] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0014] 羊抗兔β防御素104a多克隆抗体，它的核苷酸序列为
[0015] TGTTTGAAAAGGTGGAATGTCAACTCACTGAATCCTCAGAAGGAC
[0016] 本发明还提供了上述羊抗兔β防御素104a多克隆抗体制备方法，包括如下步 骤：
[0017]S1、将β防御素104a蛋白N端55-69共15个氨基酸作为羊抗兔β防御素104a 多克隆抗体的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列为CLKRWNVNSLNPQKD，合成羊β防御 素104a多肽，纯度> 75%。
[0018]S2、取步骤S1所得的1.5mg β防御素104a多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备 用；
[0019]S3、采用AbMax标准程序（42天），使用免疫原KLH-CLKRWNVNSLNPQKD多肽免疫兔 子，采用步骤S2所得的免疫原进行若干次加强免疫，多肽-BSA的多抗效价达到标准：血清 滴度多1 : 50000,第28天每只放血20ml并加强免疫，若动物无异常情况，则在第42天终 放血，得羊抗兔β防御素104a多克隆抗体。
[0020] 上述抗体可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和Western Blotting检测，用于免疫组织化学时浓度为1 : 100-500;用于细胞免疫荧光化学时，浓度 为 1 : 50-200;用于Westernblotting时，浓度为 1 : 500-1000。
[0021]ELISA检测抗血清效价
[0022] 将0. 5mgβ防御素104a多肽偶联到BSA，脱盐后作为检测抗原备用。在免疫后的 第25天取血，用β防御素104a多肽和多肽-BSA包板（lOOng/well)，进行ELISA评价， ProteinG纯化抗体识别肽-BSA滴度达0· 005ug/ml。
[0023] 多克隆抗体亲和纯化与评价
[0024] 用lmgi3防御素104a多肽制备免疫亲和柱，选择信号较好的兔血，进行免疫亲和 纯化10-30ml血清，获得l-3mg免疫亲和纯化抗体。用β防御素104a多肽和多肽-BSA包板 (lOOng/well)，通过ELISA初步评价免疫亲和纯化后抗体效价，亲和纯化抗体识别肽-BSA 滴度能达到〇.〇〇〇lug/ml。
[0025] 实施例1
[0026] 用于山羊附睾头组织的免疫荧光化学，稀释比例1 : 50。绿色荧光处为β防御素 l〇4a强阳性信号区域。
[0027] 实施例2
[0028] 用于山羊附睾体免疫组织化学，稀释比例1 : 200。褐色区域处为β防御素104a 强阳性信号区域。
[0029] 实施例3
[0030] 用于不同发育阶段山羊附睾体组织β防御素104a蛋白Westernblotting的定 量分析。
[0031]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 羊抗兔f3防御素l〇4a多克隆抗体，其特征在于，它的核苷酸序列为TGTTTGAAAAGGT GGAATGTCAACTCACTGAATCCTCAGAAGGAC。2. 羊抗兔0防御素l〇4a多克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤： SM# P防御素104a蛋白N端55-69共15个氨基酸作为羊抗兔P防御素104a多克 隆抗体的抗原表位，合成羊P防御素l〇4a多肽； 52、 取步骤Sl所得的I. 5mg|3防御素104a多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备用； 53、 采用AbMax标准程序（42天），使用免疫原KLH-CLKRWNVNSLNPQKD多肽免疫兔子， 采用步骤S2所得的免疫原进行若干次加强免疫，多肽-BSA的多抗效价达到标准：血清滴度 彡1 : 50000,第28天每只放血20ml并加强免疫，若动物无异常情况，则在第42天终放血， 得羊抗兔P防御素l〇4a多克隆抗体。3. 如权利要求2所述的羊抗兔P防御素104a多克隆抗体制备方法，其特征在于，所述 抗原表位的氨基酸序列为CLKRWNVNSLNPQKD。4. 如权利要求1所述的羊抗兔P防御素104a多克隆抗体的应用，其特征在于，该抗体 可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和Western Blotting检测。5. 如权利要求4所述的羊抗兔0防御素104a多克隆抗体的应用，其特征在于，用于 免疫组织化学时浓度为1 : 100-500;用于细胞免疫荧光化学时，浓度为1 : 50-200;用于 Western blotting 时，浓度为 1 : 500-1000。
【专利摘要】本发明公开了一种羊抗兔β防御素104a多克隆抗体及其制备方法和应用，该抗体可以用于山羊和绵羊的免疫组织化学、免疫荧光化学和Western？Blotting检测，用于免疫组织化学时浓度为1:100-500；用于细胞免疫荧光化学时，浓度为1:50-200；用于Western？blotting时，浓度为1:500-1000。
【IPC分类】C07K16/06, G01N33/68, C07K16/18
【公开号】CN105237636
【申请号】CN201510744858
【发明人】张春香, 白元生, 任有蛇, 张国林, 李迪, 师周戈, 赵宇琼, 焦光月
【申请人】山西农业大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月31日