一种结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，特别设及一种结 核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，其病原体是结核分枝杆 菌，是人类所知的最古老的一种传染病。结核分枝杆菌（妳coAacteriiw MTB)的耐药性问题已成为新世纪结核病控制的难题之一。随着抗结核药物的广泛使用，W及结核分枝杆菌染色体的突变，导致结核耐药问题日益严重。
[0003] 异烟阱（Isoniazid, INH)是结核化疗方案中的一线药物之一，可通过氧依赖途径 抑制结核分枝杆菌胞壁酸的合成，从而起到杀菌作用。目前已发现结核分枝杆菌对异烟阱 耐药设及多个基因变化：katG, inM, kasA, n化，及OxyR-址pC基因连接区。而研究证 明，katG突变导致的结核分枝杆菌触酶-过氧化物酶活性降低或缺失可W解释90% W上的 INH耐药。最普遍的katG突变是发生在第315位密码子，而其它位点密码子突变造成INH 耐药也有陆续报道。因此，建立方便快捷经济的katG突变检测方法，对实现早期迅速对结 核患者的结核分枝杆菌异烟阱耐药鉴定非常重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌新型KatG耐药突变位点的试剂 盒。
[0005] 通过与结核分枝杆菌标准株H37RV序列（NC_000962. 3)的比对，发明人从临床分 离的耐异烟阱结核分枝杆菌katG基因中发现了未报道的2个突变位点：294GGG和296ATC。 同时，该耐药株katG基因有且仅有此2个突变位点。通过克隆质粒及MIC值测定证实katG 基因294GGG，296ATC，590AGG，690GCC位点的突变可W导致显著异烟阱耐药。其中590AGG， 690GCC位点突变的发生是在质粒克隆过程中自发发生的，经过生物信息学分析，运两个位 点突变也未有研究报道。针对运4种突变位点，发明人研发结核分枝杆菌katG耐药突变位 点检测试剂盒，如PCR-巧光探针法，为耐异烟阱结核患者的早期诊断提供分子检测基础。
[0006] 本发明的有益效果是： 本发明的结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，为耐异烟阱结核患者的早期 诊断提供分子检测基础。有利于对结核患者进行个性化治疗，达到更好的治疗效果。
【具体实施方式】
[0007] 下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0008] 结核分枝杆菌的药敏实验 参照结核分枝杆菌药敏实验标准比例法。从培养平板或者培养管中挑选适量的菌体移 到磨菌器底部，揽动均匀成为乳酪状，W 0.5%Tween80生理盐水溶解后，将菌悬液与标准 麦氏比浊管比浊，即配成Img/ml的菌悬液。静置片刻，使菌液中的颗粒或菌块沉淀后，将 其依旧用0.5%Tween80生理盐水倍比稀释，稀释为两种浓度，分别为：10-2mg/ml，10-4mg/ ml的菌悬液。将上述两个浓度的菌悬液0.1ml接种于含药及对照培养基斜面或表面。接 种时，使菌液尽可能均匀分散于培养基表面。37 °C培养，4-6周观察结果。计算耐药百分 比。耐药百分比=含药培养基上生长菌落数/对照培养基生长菌落数*1〇〇%，〉1%者为耐药， <1 %为敏感。本实验所使用的抗结核药物及浓度为：异烟阱，0.2yg/mL;利福平，40yg/ 血；链霉素，4Jig/mL;乙胺下醇，2Jig/血。
[000引质粒构建 质粒载体为pMV306整合质粒（pMV361的衍生质粒)。pMV306克隆质粒电转入耻垢分 枝杆菌（MS)后，不能自主复制。根据位点特异性重组原理，PMV306克隆质粒会被整合入的 耻垢分枝杆菌基因组中，外源基因从而被高效表达，可用卡那霉素平板来筛选重组子。本实 验通过基因克隆方法，把临床耐异烟阱结核分枝杆菌必姑M35的katG基因W及katG野生 型基因分别克隆在PMV306载体上。所使用的酶切位点为：HindIII和化nl。
[0010] 质粒电转 分别把pMV306-iW7 M35 katG和pMV306-katG Wt质粒电转入耻垢分枝杆菌(非条件致 病菌，能够进行高频率的外源性DNA转化)，用含异烟阱8y g/mL及卡那霉素40 y g/mL的抗 性平板筛选电转子，得到克隆菌株。
[0011] MIC实验 分别表达必姑M35 katG基因W及katG野生型基因的克隆菌株，用7H9液体培养基过 夜培养，制备成1mg/ml菌悬液。菌悬液稀释10倍后取10iiL菌液，加入含不同异烟阱药 物浓度梯度的7H9液体培养基中。37°C培养4周，肉眼观察菌液是否浑浊，判断MIC值。本 实验所用异烟阱药物浓度梯度为：〇, 1，2,4,8,16, 32,64,128, 256, 512yg/mL。
[001引 PCR-巧光探针法 PCR-巧光探针法是在PCR基础上加入一种与祀基因序列互补的巧光双标记的寡核巧 酸探针，探针的5'端标记巧光报告基团，3'端标记巧光泽灭基团。利用化q DNA聚合酶和 根据祀序列设计的特异性引物、探针，特异识别祀序列区域，在化q DNA聚合酶的作用下，能 将已跟祀序列互补配对的探针酶切降解，使报告基团和泽灭基团分离，从而产生巧光信号， 进而对SNPs进行很好的区分，并通过巧光扩增曲线客观判断突变类型的存在。
[0013] 实验结果 临床耐异烟阱结核分枝杆菌必M35耐药表型
临床耐异烟阱结核分枝杆菌必姑M35 katG基因测序
[001引 INH的MIC值测定
KatG结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒 在确定上述突变位点之后，通过现有技术即可制备得到其检测试剂盒。如PCR-巧 光探针试剂盒，该试剂盒中主要原材料有：TaqDNA聚合酶、引物、Taqman-MGB探针、 lOXbuffer、dNTPs、MgClz、甜菜碱、DMS0、阴性对照和阳性对照等。试剂盒中阳性对照来源 于人工构建的含祀序列片段的大肠杆菌工程菌DNA，无感染活性，无潜在的生物安全危险。 阴性对照为超纯水。
[0017] 也可W采用其他公开的SNP检测方法原理，设计出对应的检测试剂盒。
【主权项】
1. 一种结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于：其包括可以检测出 KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4 个点突变中至少一个试剂。2. 根据权利要求1所述的KatG结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，其特征 在于：其包括可以检测出KatG294GGG，296ATC两个点突变位点的试剂。3. 根据权利要求1所述的KatG结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，其特征 在于：其包括可以检测出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4个点突变的试剂。4. 根据权利要求1所述的KatG结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，其特征 在于：可以检测出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4个点突变的试剂相互独立。5. 根据权利要求1所述的KatG结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒，其特征 在于：可以检测出KatG294GGG，296ATC，590AGG，690GCC4个点突变试剂为PCR-荧光探针。
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌KatG耐药突变位点检测试剂盒。通过与结核分枝杆菌标准株H37Rv序列（NC_000962.3）的比对，发明人从临床分离的耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因中发现了未报道的2个突变位点：294GGG和296ATC。同时，该耐药株katG基因有且仅有此2个突变位点。通过克隆质粒及MIC值测定证实katG基因294GGG，296ATC，590AGG，690GCC位点的突变可以导致显著异烟肼耐药。其中590AGG，690GCC位点突变的发生是在质粒克隆过程中自发发生的，经过生物信息学分析，这两个位点突变也未有研究报道。针对这4种突变位点，发明人研发结核分枝杆菌katG耐药突变位点检测试剂盒，如PCR-荧光探针法，为耐异烟肼结核患者的早期诊断提供分子检测基础。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/32
【公开号】CN105219860
【申请号】CN201510678805
【发明人】田国宝, 黄曦, 钟兰兰
【申请人】中山大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日