一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法
【专利说明】-种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及外源基因导入微生物的方法，尤其设及一种将构建的含有外源基因的 质粒导入酵母菌的高效超声波转化方法。 (二）【背景技术】
[0002] 胆固醇氧化酶在食品开发、医疗保健、临床检测、生物农药等方面具有广泛的应用 价值。目前国内胆固醇氧化酶市场供应短缺，都从国外进口。随着研究深入，它的市场范围 也从最初的临床诊断试剂扩展到食品加工、制药工业、生物化学和生物抗虫等领域，产品需 求量越来越大。但是野生菌株达不到工业化生产要求，故目前都集中在通过基因工程方法 来提高胆固醇氧化酶产量。而常规的基因工程方法要求有高端仪器设备，所用试剂昂贵且 大多对人体和环境有害，超声波作为一种物理方法可W解决运种不利。
[0003] 转化是指受体菌直接从周围环境中吸收供体菌游离的DNA片段，并整合入受体菌 基因中，从而获得了供体菌部分遗传性状的过程。通常可经过物理或者化学的方法来提高 转化率。传统的方法有化学促进法，载体介导法和机械法等，运些方法尽管得到广泛应用， 也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的过程繁冗，有的成本昂 贵，特别是一些细胞只对某一个或某几个方法敏感。而物理方法是基于细胞膜的破坏来提 高通透性，不依赖于细胞型，因此更具有广泛应用价值。超声波是一种传统的细胞破壁技 术，被认为是一种潜在的转化方法。 (H)
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，该方法新颖、转化条件 溫和、成本低、绿色环境，易于实现基因转化的方法，解决了现有方法转化率低，细胞活力 低，易死亡等问题。 阳0化]本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供一种超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，所述方法为：将携带外 源基因的表达质粒与酵母菌感受态细胞悬液混合，加入二甲基亚讽构成反应液，调节反应 液抑值至5. 0~6. 0,在28~32°C、超声波场强200~500W的条件下进行转化反应，转化 反应结束后，筛选获得含外源基因的酵母菌的阳性转化子；所述酵母菌感受态细胞悬液是 由酵母菌感受态细胞与冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液重悬而成。
[0007] 进一步，所述二甲基亚讽在反应液中体积终浓度为1-4%。
[0008] 进一步，所述转化反应在28~32°C、超声波场强200~500W的条件下反应10~ 30min〇
[0009] 进一步，所述携带外源基因的表达质粒中外源基因为胆固醇氧化酶基因，核巧酸 序列为沈QIDNO. 1所示。
[0010]
[0011] 进一步，所述酵母菌为毕赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115,购自invitrogen公 司。
[0012] 进一步，所述携带外源基因的表达质粒与酵母菌感受态细胞悬液体积比为 1:40-55,所述酵母菌感受态细胞悬液中湿菌体含量为1XIO7~1X10 8个细胞/ml。
[0013] 进一步，所述酵母菌感受态细胞按如下步骤制备：将酵母菌接种至YTO液体培养 基中，28~30°C振荡培养过夜，取培养液W体积浓度10%的接种量接种到YTO液体培养基 中，28~30°C培养至ODe。。= 1. 3~1. 5,在4°C、1500r/min条件下离屯、5-lOmin，收集湿菌 体；将湿菌体置于冰水预冷的装有无菌水的无菌聚丙締管中，于4°C，12(K)r/min离屯、5min， 弃上清，重复操作2次（即加入无菌水重悬沉淀并离屯、，后一次无菌水体积用量为上一次的 50% )，再用冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，4°C，12(K)r/min离屯、5min， 弃上清，用冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，获得酵母菌感受态细胞悬 液。
[0014] 进一步，所述携带胆固醇氧化酶基因的表达质粒为pPICZB-choB载体质粒。
[0015] 本发明所述超声波辅助外源基因转化酵母菌的方法，具体按如下步骤进行：
[0016] (1)酵母菌感受态细胞的培养和收集
[0017] 挑取酵母菌（优选毕赤酵母菌GSl15)单菌落，接种在5mLYro液体培养基中， 30°C振荡培养过夜，再将培养液W体积浓度10%的接种量转移到50mLYTO液体培养基中， 28-30°C培养到ODe。。= 1. 3~1. 5,4°C1500r/min离屯、5-lOmin，收集湿菌体；将湿菌体置 于冰水预冷含50mL无菌水的无菌聚丙締管，于4°C，12(K)r/min离屯、5min，弃上清，每管再 用50血的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬，4°C，120化/min离屯、5min，弃上清，再用25血 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬，4°C，120化/min离屯、5min，弃上清，沉淀用2血的冰预 冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，4°C，120化/min离屯、5min，弃上清，沉淀再用 200yL的冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，获得酵母菌感受态细胞悬液；
[0018] (2)W酵母菌为宿主的基因转化研究
[0019] 将酵母菌感受态细胞悬液中加入体积终浓度1-4%的二甲基亚讽构成反应液，添 加携带胆固醇氧化酶基因的pPICZB-choB载体质粒，在抑值至5. 0~6. 0、28~32°C、超声 波场强200~500W下，经超声波作用进行转化反应，分别考察场强和处理时间等参数对转 化的影响；
[0020] (3)阳性转化子的筛选
[0021] 当转化结束后，将转化后的菌液涂布到含80~120yg/mL的zeocine的YTO平板 上进行筛选，28~30°C条件下培养3~4山得到阳性转化子；
[0022] (4)阳性转化子的鉴定
[0023] 随机选取转化平板上的转化子提取基因组DNA，W其为模板，采用特异性引物进行 PCR验证。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5'-GCGAATTCTCACTGGATGT 〔664〔6464164-3'。？〇?反应条件为：941：5111111;941：303,551：303,72°(：1111111，30个循环； 72°C5min;凝胶电泳检测重组载体是否插入毕赤酵母基因组。
[0024] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[00巧]1)目前报道多集中在超声诱导植物和动物基因转化，本发明拟W超声波方法诱导 微生物基因转化。
[00%] 2)常用的基因转化方法有基因工程法和电穿孔法，基因工程法要求有高端仪器设 备，所用试剂昂贵且大多对人体和环境有害；电穿孔要求有较低的离子介质和较高的电压， 并且接合要求有直接细胞-细胞接触。本发明所述超声波诱导基因转化方法更加环保，不 依赖于细胞型，且转化率和电转化率相当。当前电转化是主要转化方法，本发明超声波促进 转化不仅具有前述优势，而且转化率与报道电转化率较高的文献相当甚至超过，如王永兴 的ECM830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用（动物医学进展，2006,27(增）：82-84), 转化效率约为3Xl(f/yg DNA，本发明转化率达3. 5Xl(f/yg DNA。 (四）
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker,泳道1为阳性转化 子。
[002引图2为实施例2阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker,泳道1为阳性转化 子。
[0029] 图3为实施例3阳性转化子筛选凝胶电泳图，泳道M为Marker,泳道1为阳性转化 子。 (五）
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此： 阳03UYPD液体培养基配方为：酵母膏lOg，蛋白腺20g，葡萄糖20g，1000 ml水。
[0032] YPD平板配方为：酵母膏lOg，蛋白腺20g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，1000 ml水。 阳〇3引 实施例1
[0034] (1)毕赤酵母菌感受态细胞的培养和收集
[0035] 挑取毕赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115单菌落（购自invitrogen公司），接种 至5mLYTO液体培养基中，28 °C振荡培养过夜，W体积浓度10 %接种量再转移到50mLYPD 液体培养基中，28°C培养到ODe。。= 1. 3,将培养液在4°C、150化/min离屯、5-lOmin，收集湿菌 体。将湿菌体倒入到一个用冰水预冷的含50mL无菌水的无菌聚丙締管，于4°C，120化/min 离屯、5min，弃上清，每管再用50血的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。4°C，120化/min离 屯、5min，弃上清，再用25血的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬，4°C，120化/min离屯、5min， 弃上清。用2mL的冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬。4°C，120化/min离屯、 5min，弃上清，再用200yL的冰预冷的Imol/L的山梨醇水溶液将菌体沉淀重悬，得待转化 感受态宿主细胞悬液。
[0036] (2) W毕赤酵母菌为宿主的基因转化研究
[0037] 将胆固醇氧化酶基因ChoB克隆到pPICZB-载体质粒上。
[0038] 将含胆固醇氧化酶基因choB的pPICZB质粒（质粒浓度应不小于70ng/JiL)与步 骤（1)获得的细胞悬液（悬液中湿菌体含量为IXlO8细胞/mU^体积比为1:40混合，即 取8yL质粒与320yL细胞悬液混合，再加入体积终浓度2 %的二甲基亚讽，置于转化杯中， 抑调至5. 0 ;溫度调至28°C，超声波场强为200W，处理时间为20min。
[0039] (3)阳性转化子的筛选 W40]当转化结束后，将转化液离屯、，收集湿菌体，加入SOOiiL冰预冷的Imol/L的山梨 醇水溶液将转化后的菌体混匀，转至1. 5mL的EP管中，30°C静置培养比。将菌体悬液涂布 于含80yg/mLzeocine的YPD平板上，每100化，200化，300yL涂布一块平板，平板在 28°C条件下培养4