超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 分子影像学为活体状态下检测干细胞迁徙、归巢、存活、增殖及定向分化等状况提 供了可行的解决平台。
[0003] 在各种影像手段中，MRI有着极精细的空间分辨率和极佳的组织分辨率，可高 分辨地显示组织解剖结构的同时，对深部组织的分子影像学特征进行精细、准确的定位、 定量分析，是最理想的分子影像学分析技术之一。目前，不少学者采用超顺磁性氧化铁 (Supe巧arama即etic iron oxide, SPIO)体外标记干细胞，使用MRI能够无创、在体、动态、 准确地对移植细胞进行活体示踪成像，根据祀器官MRI信号改变来判断移植细胞情况。
[0004]SPIO是由分子式为化23+03M2+0氧化铁微晶组成，当M2+为化2咐，SPIO具有顺磁性。 在不存在外加磁场时，SPIO内部的磁场无取向，净磁场为零；而在外加磁场存在时，磁偶极 子发生取向，从而使静磁矩急剧提高，大大缩短周围质子的Ti、T2/T2*弛豫时间，使SPIO所 处局部在MR图像中与周边部位产生显著对比，SPIO的运种MR信号对比增强作用取决于离 子的成分、粒径、离子本身的饱和磁化、在单位成像体积内离子的浓度W及采集MR数据时 所用的物理参数。
[0005] 常用的氧化铁纳米粒子合成方法有共沉淀法、微乳液法、超声空化法等。共沉淀法 是将摩尔比2 : 1的化与化2+盐在水溶液中同时水解沉淀，或化2+盐在氧化剂存在条件 下部分氧化沉淀实现化3〇4纳米粒子的合成。共沉淀法具有方法简单、成本低廉的优点。但 是共沉淀方法存在粒度分布宽、易团聚的缺点，而且由于氧化铁与水之间反应较为复杂，可 生成多种化合物，因此产物中常混入其它相杂质，而不能充分发挥纳米氧化铁在生物体系 中的作用。经过改进的微乳液法及超声空化法制备的纳米氧化铁，普遍存在结晶度差、磁性 能低，及其粒度、形貌难W控制的缺点。目前商业化的氧化铁纳米粒子Resovist (Shering) 是由共沉淀方法制备的，由葡聚糖包裹，用其标记干细胞时需使用转染剂，如常用的左旋多 聚赖氨酸任oly-L-lysine，化L)介导干细胞进行SPIO标记，W提高细胞对SPIO颗粒的摄 入。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用，所述超顺磁性氧化铁纳米粒子 表面的Zeta电位为正或者0。
[0009] 优选的，超顺磁性氧化铁纳米粒子的表面有阳G/PEI或阳G/PVP修饰。
[0010] 优选的，超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~33nm。
[0011] 优选的，PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为21~33nm。
[0012] 优选的，PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~28nm。
[0013] 优选的，超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12yg/ml~25yg/ml， 解育时间为IOh~20h。
[0014] 优选的，PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12yg/ ml~25y邑/ml，解育时间为10~1地。
[0015] 优选的，PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为25yg/ ml,解育时间为10~14h。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0017] 本发明公开了超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的新应用。研究发现，通 过改变氧化铁纳米粒子表面电荷，使其带正电或0电荷有助于简化其对干细胞的标记程 序，并能显著提高标记效率。
[0018] 无需使用任何转染剂，PEG/PEI修饰的SPI0(12 y g/ml、25 y g/ml)和阳G/PVP修饰 的SPIO (25 y g/ml)，解育时间为12h，可W相对安全有效的标记大鼠脂肪干细胞（ADSCs)。
[0019] 本发明多元醇法合成的SPIO的T2负性效应可W随着细胞内铁含量的增加而增 强，呈明显的负相关，说明其可作为铁类对比剂应用于活体示踪成像。
[0020] 体外条件下MRI成像（T2-mapping序列）可敏感显示SPIO标记的细胞，阳G/PEI 修饰的SPIO要远远比商用的SPIO快速有效，并随着解育浓度的增加，细胞对SPIO吸收增 加，可作为一种优势的新型的磁性标记物用于干细胞示踪成像。
【附图说明】
[0021] 图1为SPIO纳米粒子的TEM照片；
[0022] 图2为SPIO纳米粒子的磁滞回线图；
[0023] 图3为阳G/PEI修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图；
[0024] 图4为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图；
[00巧]图5为流式细胞仪对细胞表面抗原表达的检测结果图；
[0026] 图6为阳G/PEI修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图；
[0027] 图7为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图；
[0028] 图8为透射电子显微镜TEM观察细胞超微结构；
[0029] 图9为阳G/PEI修饰的SPIO标记率；
[0030] 图10为PEG/PVP修饰的SPIO标记率；
[0031] 图11为阳G/PEI修饰的SPIO标记持久性；
[0032] 图12为阳G/PVP修饰的SPIO标记持久性；
[003引图13为细胞内铁含量与MRI成像的相关性。
【具体实施方式】
[0034] 英文缩略词如下：
[0035] 聚乙締[I比咯烧酬（polyvin}d pyrrolidone)为PVP，聚酸酷亚胺 (Polyetherimide)为阳I，聚乙二醇（polyeth}dene glycol)为阳G。
[0036]W下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0037]实施例I超顺磁性氧化铁纳米粒子的制备
[003引多元醇法制备磁性标记物：称取15g阳G-1000 和0. 3g的阳I(分子量为1800)至 50mlS口烧瓶中，称取20g的阳G-1000 和0. 3g的PVP(分子量为58000)至另一个50ml =口烧瓶中，在80°C揽拌至澄清，随后向两个烧瓶中加入0. 7g化(acac)3，保持此溫度揽拌 lOmin，在氣气保护下逐渐加热至180、200、220、240、260°C-共反应比，然后停止加热冷却 至6(TC。将反应生成物与甲苯W1:3的体积比混合于烧杯中，超声分散后在烧杯底部进行 磁性分离，使黑色物质沉淀。弃去上清液，将黑色物质充分清洗，用丙酬再次清洗后在60°C 真空干燥，得到黑色粉末，置入透析袋中透析2~3d，每1化更换一次去离子水，直到烧杯内 去离子水颜色澄清，分别制备得到PEG/PEI修饰的SPIO和PEG/PVP修饰的SPI0。
[0039] 性能检测：采用透射电子显微镜观察样品的形貌、粒径W及分散状态；zeta电势 分析仪测定样品在水中的zeta电势；超导量子干设仪测定样品的磁性能。
[0040] 结果分析如下：
[0041] 1)TEM表征：上述合成的阳G/PEI修饰的SPIO(见图la)W及阳G/PVP修饰的 SPIO(见图化）均能形成粒度均一、单分散性的球形粒子，基本没有出现粒子之间相互抱团 的现象。取TEM照片中100个粒子，测量其平均粒径，结果与谢乐公式计算所得的平均粒径 基本一致，表明合成的化3〇4纳米粒子是单个晶体。
[0042] 2)水合动力学粒径：PEG/PEI修饰的SPIO的水合动力学粒径平均值为25nm，PEG/ PVP修饰的SPIO的水合动力学粒径平均值为20nm。上述两种化304纳米粒子放置90d后测 得的水合动力学粒径平均值无变化，说明合成的磁性标记物在水溶液中能够长时间稳定分 散。
[0043] 3)去离子水中的zeta电位及稳定性：zeta电位是表明胶体分散体系稳定性的一 个重要指标。合成的氧化铁纳米粒子分散在去离子水中，其中PEG/PEI修饰的SPIO的zeta 电位为35mV，PEG/PVP修饰的SPIO的zeta电位为OmV;在室溫放置30天W上没有沉淀产 生，说明该方法制备的磁性标记物具有良好的水分散性。
[0044] 4)SPIO纳米粒子的弛豫效能：磁滞回线显示剩磁和矫顽力均为零，说明制备的两 种化3〇4纳米粒子均具有超顺磁性（见图2)。
[0045] 综上所述：多元醇法合成的SPIO(包括阳G/PEI修饰的SPIOW及阳G/PVP修饰的 SPIO)粒径均一、结晶度好和磁性强，在溶液中表现出良好的水分散性及稳定性，能更好的 进行造影成像。
[0046] 实施例2超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记SD大鼠脂肪干细胞中的应用
[0047] -、SD大鼠脂肪干细胞的分离、纯化和鉴定
[0048] 取4周龄W内的SD大鼠，无菌条件下取腹股沟处的脂肪组织，反复冲洗，剪碎成 大约Imm3细小组织块；加入I型胶原酶进行恒溫振荡消化，中止消化后进行离心种植在含 10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中，标记为原代细胞Pe，37°C、5%C〇2培养箱中静置培养； 待细胞长至80% -90%融合时（约7-8d)，纯化提取出的ADSCs,W1 :2的比例传代至Pi代， 重复上述步骤，将ADSCs传代至Ps~P7代备用。
[0049] 二、超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记SD大鼠脂肪干细胞中的应用
[0050] (1)有效标记率测定：取6孔板，细胞铺板。设置=组细胞，分别为不加任何磁性 标记物的未标记组、PEG/PEI修饰的SPIO为标记组1、阳G/PVP修饰的SPIO为标记组2。其 中标记组I和标记组 2,设置不同浓度（0Jig/ml、6Jig/ml、12Jig/ml、25Jig/ml、50Jig/ml、lOOyg/ml)和不同时间化11、1211、2地、4她）对细胞进行解育，然后进行普鲁±蓝染色，初步 选定细胞染色达到95%W上的标记率，并且细胞形态无明显改变的解育浓度和时间。未标 记组中不加任何磁性标记物，重复上述解育及后续步骤。结果见表1和表2。
[005。 表1、不同浓度阳G/PEI修饰的SPIO解育不同时间后ADSCs的形态变化和铁标记 率测定
[0054] 表2、不同浓度阳G/PVP修饰的SPIO解育不同时间后ADSCs的形态变化和铁标记 率测定
[0056] 由表1和表2可知：标记组1中PEG/PEI修饰的SPIO安全有效的标记浓度为 12yg/mlW及25yg/ml，标记时间为12h;标记组2中阳G/PVP修饰的SPIO标记浓度为 25yg/ml和50yg/ml，标记时间为12h。而既往商用SPIO与转染剂结合后要达到有效标记 率的解育浓度为25-50yg/ml，解育时间是18-2地，说明运种新型SPIO包括PEG/PEI修饰 的SPIO和PEG/PVP修饰的SPIO均能更快速有效的标记干细胞。
[0057] 似标记安全性检测：选择不影响细胞形态的前提下，达到95%W上铁染色率的 解育浓度和解育时间进行安全性检测，包括细胞活力、细胞增殖力、细胞表面抗原表达、成 神经诱导性。
[0058] ①细胞活力：将未标记组和标记组的单细胞悬液与0. 4%台吩蓝溶液W1:1比例 混匀，=分钟内，用计数板计数后计算活细胞率（％ )，结果见表3