Sclerotiorin衍生物及其制备方法与作为抗甲型H1N1流感病毒剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Sclerotiorin衍生物及其制备方法与应用，特别是涉及一种对 甲型HlNl流感病毒具有极强的抑制活性的Sclerotiorin衍生物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 甲型HlNl流感病毒是A型流感病毒，携带有HlNl亚型猪流感病毒毒株，包含有禽 流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪 流感病毒特征。自2009年3月18日在墨西哥爆发甲型HlNl流感病毒以来，已经陆续发现 感染、死亡病例。因此，寻找安全高效的抗甲型HlNl流感病毒剂成为国际上急需解决的课 题。海洋天然产物被认为是新型抗病毒剂的重要来源。海洋微生物由于在实验室中可以 大规模发酵，不易破坏自然环境，而成为活性海洋化合物的最重要来源。然而，近年来尚未 见到直接从海洋微生物中来源的天然化合物或其衍生物作为抗甲型HlNl流感病毒剂的应 用。
[0003] (Centers for Disease Control and Prevention. Update ：novel influenza A(HlNl)virus infections-worldwide, May 6,2009.MMffR Morb Mortal Wkly Rep. 2009, 58,453_458;Scalera，N.M. ;Mossad，S.B. Postgrad Med. 2009，121，43_47 ;Medina，R. A.; Garcia-Sastre，A. Nat. Rev. Microbiol. 2011，9, 590-603.) D
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的Sclerotiorin衍生物的制备方法 与作为抗甲型HlNl流感病毒剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。菌种保藏信息：保 藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏编 号：CGMCC No. 8994 ;分类命名：Penicillium sp. 〇
[0005] 本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐：
或其药学上可接受的盐。式I中R为
本发明提供式I化合物的制备方法，其特征在于先在菌 种培养基中对分离自柳珊瑚的内生真菌Penicillium sp. (TA33-1)进行菌种培养，再在发 酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得菌丝体用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次 减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分别进行正相硅胶柱层析、 S印hadex LH-20凝胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得黄色 粉末，即为（+)-Sclerotiorin ;在溶有（+)-Sclerotiorin的二氯甲烧溶液中，加入有机伯 胺和碳酸钾，反应后得到式I化合物。
[0007] 上述制备方法中菌种培养基优选含有葡萄糖0. 1 %-5.0% (重量百分比，下 同）、酵母膏 0.01 % -1 %、蛋白胨 0.01 % -1 %、琼脂 〇· 1% -3.0%、氯化钠 0.05% -5%， 其余为水，培养温度优选为0-30 °C，培养时间优选为3-15天；发酵培养基优选含有 大米1.0% -80. 0% (重量百分比，下同）、氯化钠0.05% -5%，其余为水，培养温度 优选为0-30°C，培养时间优选为10-60天；所述的正相硅胶柱层析采用的固定相 优选200-300目硅胶，流动相优选体积比为15 % -60 %的乙酸乙酯-石油醚混合溶 剂；所述Sephadex LH-20凝胶柱层析采用的流动相优选体积比为石油醚：氯仿： 甲醇=2 : I : 1的混合溶剂；所述HPLC高效液相制备色谱中采用的色谱柱为本 领域常规ODS C18柱，优选为Kromasil 10 X 250_，5 μ m，流速优选为1. 0-5. OmL/ min，流动相优选体积比为50% -80 %的甲醇-水混合溶剂；所述的有机伯胺为
[0008] 本发明从海洋真菌中获得的Sclerotiorin衍生物对甲型HlNl流感病毒具有极强 的抑制活性，可用于开发抗甲型HlNl流感病毒剂，应用前景广阔。
[0009] 本发明的另一实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备抗甲型 HlNl流感病毒剂中的应用。
[0010] 本发明中术语"药学上可接受的盐"是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成 盐。可参见"Salt selection for basic drugs"，Int. J.Pharm. (1986)，33,201_217〇
【具体实施方式】 toon] 为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但 是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实 施方式不限于以下内容。
[0012] 实施例1
[0013] (1)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌种培养
[0014] 菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏0. 2%、蛋 白胨0. 2 %、琼脂I. 0 %、氯化钠3. 0 %，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在30°C下 培养3天。
[0015] ⑵柳珊瑚内生真菌Penicillium sp. (TA33_1)的发酵
[0016] 发酵培养所用的培养基含有大米40. 0 % (重量百分比，下同）、氯化钠3. 0 %，其余 为水；真菌菌株于28°C培养30天。
[0017] (3) (+)-Sclerotiorin 的提取分离
[0018] 取60瓶步骤（2)得到的菌丝体，用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次减压浓缩 后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分别进行正相硅胶柱层析（固定相为 200-300目硅胶；流动相为30%乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，体积比）、5印1^(1^1^-20凝 胶柱层析（石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1的混合溶剂，体积比）后，再经HPLC高效液 相制备色谱分离（色谱柱为Kromasil 10X250mm，5 μπι，流速为2. OmL/min，流动相为65% 的甲醇-水混合溶剂，体积比），将所得洗脱液浓缩，得黄色粉末，即为（+)-Sclerotiorin。
[0019] 实施例2
[0020] (1)柳珊瑚内生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌种培养
[0021] 菌种培养所用的培养基含有葡萄糖0. 1% -5. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏 0. 01% -1%、蛋白胨0.01% -1%、琼脂0. 1% -3.0%、氯化钠0.05% -5%，其余为水，使用 时制成试管斜面，真菌菌株在0_30°C下培养3-15天。
[0022] (2)柳珊瑚内生真菌 Penicillium sp. (TA33-1)的发酵
[0023] 发酵培养所用的培养基含有大米I. 0 % -80. 0 % (重量百分比，下同）、氯化钠 0. 05% -5%，其余为水，真菌菌株于0-30°C培养10-60天。
[0024] (3) (+)-Sclerotiorin 化合物的提取分离
[0025] 取10-300瓶步骤（2)所得的将所得菌丝体用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3 次减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏浓缩后分别进行正相硅 胶柱层析（固定相为本领域常规正相硅胶，流动相为15% -40%的乙酸乙酯-石油醚混合 溶剂，体积比）、Sephadex LH-20凝胶柱层析（流动相为石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1 的混合溶剂，体积比）后，再经HPLC高效液相制备色谱（色谱柱为本领域常规ODS C18柱， 流速为I. 0-5. OmL/min，流动相为50 % -80 %的甲醇-水混合溶剂，体积比），将所得洗脱液 浓缩，得黄色粉末固体，即为（+)-Sclerotiorin化合物。
[0026] 实施例1-2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、 Sephadex LH-20凝胶柱层析分离、高效液相色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规 的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
[0027] 实施例3
[0028] 称取上述干燥后的（+)-Sclerotiorin (0· Imol)溶解在二氯甲烷中，常温条件下， 在充分搅拌下将有机伯胺（〇. 12mol)逐滴滴加到反应溶液中，反应1小时后，向反应物中加 入蒸馏水（200mL)来终止反应，用乙酸乙酯（500mL)进行萃取，将萃取液浓缩后，进行柱层 析，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩，重结晶后得到式I化合物。
[0029] 实施例3中未具体指明的其他有机化学反应条件，以及正相硅胶柱色谱分离等其 他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要， 进行合理的选择。
[0030] 式I化合物的具体化合物结构实例：
[0031]
[0032] 式I化合物的结构确证数据：
[0033] I :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.84(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.98(lH，d，J = 15. 6Hz, H-10), 6. 58 (1H, t, J = 2. 4Hz), 6. 41 (2H, d, J = I. 8Hz), 5. 70 (1H, d, J = 15. 6Hz, H-9)，5. 68 (1H，d，J = 9. 6Hz，H-12)，3. 83 (6H，s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 18 (3H，s，H-20)， I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m，H-14)，I. 32 (1H，m，H-14)，I. 00 (3H，d， J = 6. 6Hz，H-16)，0· 85(3H，t，J = 7. 2Hz，H-15). 13C NMR(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9(C-6)， 184. 7 (C-8)，170. 3 (COCH3)，161. 8,161. 8,147. 9 (C-I)，147. 4,144. 2,143. 2,141. 8,141. 1， 132. O(C-Il)，116. 2(C-9)，114. 3(C-5)，109. 6,109. 6,109. 6,103. 3(C-8a)，101. 8(C-4)， 84. 9 (C-7)，56. 0 (-OCH3)，55. 9 (-OCH3)，35. I (C-13)，30.1 (C-14)，23. 3 (C-18)，20. 4 (C-16)， 20. 3(C0CH3),12. 5(C-17),12. l(C-15).ESIMSm/z 526. 05/528. 05[M+H]7[M+H+2]+ (3 ： I), 547. 99/550. 01[M+Na]+/[M+Na+2] + (3 ： I), 1072. 84/1072. 77[2M+Na]7[2M+Na+2]+ (3 ： I). HRESIMSm/z526. 1981 [M+H]+ (calcd for C29H33O6NCl, 526. 1991).
[0034] 2 :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.85(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.99(lH，d，J = 15. 6Hz，H-10)，6. 50 (2H，s)，5. 68 (2H，overlapped，H-9and H-12)，3. 91 (3H，s)，3. 87 (6H， s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 19 (3H，s，H-20)，I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m， H-14)，L32(lH，m，H-14)，1.00(3H，d，J = 6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J = 7.2Hz，H-15).13C 匪R(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9 (C-6)，184. 7 (C-8)，170. 4 (COC