一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的issr标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食用菌DNA标记辅助育种领域，更具体涉及一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用。
【背景技术】
[0002]双孢蘑菇是我国的大宗食用菌之一，2014年全国双孢蘑菇总产量达200多万吨，占世界年产量的一半左右，产值超百亿元人民币。据测算，每生产I吨鲜蘑菇，即可转化I吨养殖业废料和2吨种植业废料，解决I个农村劳动力就业，因此经济效益、社会效益和生态效益显著。
[0003]双孢蘑菇的栽培起源于法国，至今已有300多年的历史，近几十年来欧美等发达国家的双孢蘑菇生产都采用工厂化生产模式，配套以产量高、周期短的工厂化生产专用品种，产品基本都鲜销。而我国上世纪20年代才从国外引进双孢蘑菇到国内栽培，80年代才形成一定规模的生产。虽然目前已有一定数量的工厂化生产厂家，但数十年来一直以农业生产为主，至今农业生产仍占到总量的80%以上，产品除鲜销外，部分还加工成罐头出口，因此所用的品种也要求以优质为主、兼顾产量的品种，如本单位选育的As2796系列。因此，具有优质性状的双孢蘑菇种质资源及新品种对我国的双孢蘑菇产业至关重要。
[0004]在双孢蘑菇育种技术上，国内外目前都以杂交育种为主，国内以本单位的同工酶辅助杂交育种为主导技术，国外仍以出菇筛选为主。上世纪90年代以后国内外多家单位均开展了 DNA分子标记辅助育种技术，在亲缘关系分析、杂交亲本选择、同核体鉴定等方面得到一定的应用，但在关键农艺性状如产量、质量、抗病、抗逆等方面的分析却鲜有成功的报道。ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat，简单序列重复区间)是一种基于微卫星序列发展起来的新型DNA分子标记技术。它利用人工设计合成的核苷酸重复序列引物对SSR(Simple Sequence Repeat，简单序列重复)之间的DNA序列进行半随机PCR扩增，可获得丰富的多态性。我们通过大规模的ISSR引物筛选和大量的菌株验证，找到了一个适用于双孢蘑菇菌株优质性状预测的ISSR标记与方法。该标记与双孢蘑菇优质性状紧密连锁，利用该分子标记能在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定菌株的优质性状，而不必经过费时费力的出菇试验，这对杂交育种中优质亲本选择与跟踪鉴定、提高育种效率有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明基于分子标记技术，建立一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用。
[0006]本发明为一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用，是利用ISSR分子标记对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增。
[0007]利用ISSR引物对双孢蘑菇菌株基因组DNA进行ISSR-PCR，优质类型的菌株能扩增出1600bp和850bp的特异性条带，所述ISSR引物的核苷酸序列为:5， -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3，。
[0008]所述的ISSR-PCR扩增条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52 °C退火45s，72°C延伸90s，扩增40个循环；72°C延伸7min，4°C保存。反应体系为:模板DNA 30 ng，引物 30 ng, dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, Taq DNA 聚合酶 I U，I XPCR 缓冲液，用ddH20补总体积至20 μ L0
[0009]所述引物在鉴定双孢蘑菇优质菌株上的应用。
[0010]本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇菌株的优质或非优质特性，该方法耗时短，操作简便，特异性强，无需出菇，省时省力。根据特异性扩增产物1900bp和850bp条带的有无来鉴定菌株的优质或非优质性状，具有该2条带的菌株为优质菌株，没有该2条带的菌株为非优质菌株。
【附图说明】
[0011]图1双孢蘑菇24个优质菌株的ISSR图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindl 11Markers ；1~24:沪 8213，8211，闽 I 号，As376，Asl671，Asl789，As321，As555，T-8205，A，D，沪 101，21，22，175，751，福罐 3，福罐 10，厦前 751，仙游 841，沪 102-1，黄岩 62，浣沙 176-4，AglO0右边箭头指示2条特异条带位置，显示24个优质菌株均扩增出850bp特异条带，有22个扩增出1600bp特异条带。图中箭头指示2个菌株未扩增出1600bp条带。
[0012]图2双孢蘑菇24个非优质菌株的ISSR图谱，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindl 11Markers ;25-48:102-2，苏锡一号，T-03，111-455，111，浣沙 176，浣沙 176-3，245-6，F4，F20，Ag6，8132D，02，7001，7601，701，Agl8，台-1，0072，S46，50-1，125，浣沙 176-2，日本 118。右边箭头指示2条特异条带位置，显示24个非优质菌株均未扩增出2条特异条带。
[0013]【具体实施方式】:
实施例1:
1.Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs购自厦门泰京生物有限公司，ISSR引物委托上海生工生物科技有限公司合成。所述ISSR引物的核苷酸序列为:5， -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3，。
[0014]2.双孢蘑菇DNA提取与电泳
双孢蘑菇DNA提取与检测按照文献[陈美元，廖剑华，李洪荣，郭仲杰，卢政辉，蔡丹凤，王泽生.双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].中国农学通报，2009，(04):149-156.]。
[0015]3.1SSR-PCR反应体系与条件
反应体系为:模板 DNA 30 ng，引物 30 ng, dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶I U，I XPCR缓冲液，用ddH20补总体积至20 μ L0扩增条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，扩增40个循环；72°C延伸7min，4°C保存。PCR产物电泳及染色拍照按照文献[陈美元，廖剑华，王波，李洪荣，卢政辉，郭仲杰，蔡丹凤，王泽生.中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J].食用菌学报，2009，(01):11-16.] ο
[0016]4.结果分析
ISSR-PCR检测结果如图1和图2，1-24号为双孢蘑菇优质菌株，其中24个菌株有22个扩增出1600bp条带，仅I号和13号菌株未扩增出，检出阳性率为91.7%, 24个菌株都扩增出850bp条带，检出阳性率为100%。25-48号为双孢蘑菇非优质菌株，均未扩增出1600bp和850bp特异性条带，2个条带的检出阳性率均为0%。因此，该标记与双孢蘑菇菌株的优质性状紧密连锁，应用该标记与方法可以非常方便地对双孢蘑菇菌株的优质或非优质性状进行区分和鉴定。
[0017]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记引物，其特征在于:所述ISSR标记引物核苷酸序列为:5’ -AGAGAGAGAGAGAGAGC-3’。2.如权利要求1所述引物用于鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记方法，其特征在于:利用ISSR标记引物对双孢蘑菇菌株的基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件为:94°C预变性5min ;94°C变性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，扩增40个循环；72°C延伸7min，4°C保存；反应体系为:模板 DNA 30 ng，引物 30 ng，dNTPs 0.1 mmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, TaqDNA聚合酶I U，I XPCR缓冲液，用ddH20补总体积至20 μ L03.如权利要求1所述引物在鉴定双孢蘑菇优质菌株上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一个鉴定双孢蘑菇优质菌株的ISSR标记及应用，利用ISSR引物对双孢蘑菇菌株进行PCR扩增，仅具有优质特性的菌株能扩增出1600bp和850bp特异片段。本发明的方法用于特异性地鉴别双孢蘑菇优质类型菌株,而不用经过出菇试验。该方法耗时短，操作简便，特异性强，可以在双孢蘑菇杂交育种中快速地鉴定菌株的质量性状，极大地提高了双孢蘑菇杂交育种的效率。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/645, C12N15/11, C12Q1/04
【公开号】CN105200133
【申请号】CN201510614637
【发明人】陈美元, 廖剑华, 蔡志欣, 郭仲杰, 李洪荣, 卢政辉, 王泽生
【申请人】福建省农业科学院食用菌研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日