焦磷酸测序法检测vkorc1基因分型的引物对及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及体外核酸检测技术领域，尤其设及一种焦憐酸测序法检测VKORCl基 因分型的引物对及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 维生素K环氧化物还原酶复合体 1(VitaminKepoxidereductasecomplex subunitLVKORCl)是维生素K代谢循环中的关键酶，华法林因抑制该酶而阻断维生素KW 辅助因子形式参与簇化酶的催化反应，抑制了凝血因子II、W、IX、X的功能活性，从而产生 抗凝作用。国内外大量研究发现，VKORCl基因突变会增加该酶对华法林的敏感性，从而增 强抗凝效果，其中比较常见的突变有启动子区的G1639A突变及1号内含子的C1173T突变。 此外，研究表明，G1639A位点与华法林抗凝疗效具有显著的相关性，其中携带突变的患者所 需相对低的华法林剂量。
[0003]VKORC1基因可分为A、B两组单体型，A组与华法林低剂量相关，B组与高剂量相关。 亚洲人中A组单体型的频率高达85% -89%，研究较多的SNP位点有内含子11730T和5' 上游区的1639G〉A。目前研究已经证实1639G〉A和11730T两个位点是完全连锁的。华法 林的作用途径是通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子F2、F7、F9、F10,从而发挥抗 凝作用。体内环氧型维生素K被还原为氨酿型维生素K，并由维生素环氧化物还原酶复合 体（VKORC)完成华法林抑制该酶的产生。VKORCl基因突变导致其对华法林的敏感性发生变 化，VK0RC1-1639AA(1173TT)基因型患者需要的华法林剂量显著低于-1639GA或GG(1173TC 或CC)。
[0004] 华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一， 用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、屯、脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗 窗较窄，很小的剂量都可能导致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂 量者之间可相差10倍W上。美国食品药品监督管理局（抑A)明确指出：在使用华法林时， 建议检测VKORCl基因型。
[0005] 焦憐酸测序（Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序（即，确定DNA 中核巧酸的顺序）方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分 析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶 催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若 该dNTP与模板配对，聚合酶就可W将其渗入到引物链中并释放出等摩尔数的焦憐酸基团 (PPi),PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中渗入的核巧酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分 析出峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦憐酸测序技术 检测VKORCl基因分型的产品。
[0006]目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有"金标准"之称的PCR-直接测序法 对VKORCl基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%W 上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10%的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接 测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述方法检测VKORCl基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操 作繁琐及成本高的技术问题，本发明提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单 并有效满足临床检验要求的焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的引物对及试剂盒。
[0008] 本发明提供了一种焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的引物对，所述VKORCl基 因检测的多态性位点为VKORClG1639A和/或VKORClCl173T，所述引物对包括：
[0009] (1)对于VKORClG1639A等位基因，
[0010] 扩增引物为：
[0011] VKORClG1639A正向扩增引物：
[0012] 5' -CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGT-3'(沈QIDNO. 1);
[001引VKORClG1639A反向扩增引物：
[0014] 5' -TGTTGGCCAGGCTTGTCTTMA-3,（沈QIDNO. 2);
[0015]VKORClG1639A测序引物：5, -GCGTGAGCCACCGCA-3'（SEQIDNO. 3);
[0016] 其中，所述VKORClG1639A正向扩增引物的5'端进行生物素标记；
[0017] (2)对于VKORClCl173T等位基因，
[001引扩增引物为：
[0019]VKORClC1173T正向扩增引物：
[0020] 5, -AAAGCAGGGCCTACGGAGTAGC-3,（沈QIDNO. 4);
[0021] VKORClC1173T反向扩增引物：
[0022] 5, -CCCCGACCTCCCATCCTAGT-3,（沈QIDNO. 5);
[0023]VKORClC1173T测序引物：5, -CCAGGAGATCATCGAC-3,（SEQIDNO. 6);
[0024] 其中，所述VKORClC1173T反向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[00巧]本发明还提供了一种焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的试剂盒，所述VKORCl基因检测的多态性位点为VKORClG1639A和/或VKORClCl173T，所述试剂盒包括：
[0026] (1)对于VKORClG1639A等位基因，
[0027]VKORClG1639A正向扩增引物：
[0028] 5, -CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGT-3,；
[0029]PCR反应液1，所述PCR反应液1含有VKORClG1639A反向扩增引物： 5' -TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAA-3';
[0030]VKORClG1639A测序引物：5, -GCGTGAGCCACCGCA-3,；
[003。 其中，所述VKORClG1639A正向扩增引物的5'端进行生物素标记；
[0032] (2)对于VKORClCl173T等位基因，
[0033]VKORClC1173T反向扩增引物：
[0034] 5' -CCCCGACCTCCCATCCTAGT-3,；
[003引 PCR反应液2,所述PCR反应液2含有VKORClCl173T正向扩增引物： 5' -AAAGCAGGGCCTACGGAGTAGC-3'；
[0036]VKORClC1173T测序引物：5' -CCAGGAGATCATCGAC-3,；
[0037] 其中，所述VKORClC1173T反向扩增引物的5'端进行生物素标记。
[0038] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：
[0039]VKORClG1639A阳性对照品1，其为插有沈QIDNO. 8所示核巧酸序列的VKORCl G1639A野生纯合子质粒；
[0040]VKORClG1639A阳性对照品2,其为所述VKORClG1639A野生纯合子质粒与插有 SEQIDNO. 9所示核巧酸序列的VKORClG1639A突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
[0041]VKORClG1639A阳性对照品3,其为插有沈QIDNO. 9所示核巧酸序列的 VK0RC1G1639A突变纯合子质粒；
[004引VKORClC1173T阳性对照品1，其为插有沈QIDNO. 10所示核巧酸序列的VKORCl C1173T野生纯合子质粒；
[0043]VKORClC1173T阳性对照品2,其为所述VKORClC1173T野生纯合子质粒与插有 SEQIDNO. 11所示核巧酸序列的VKORClCl173T突变纯合子质粒组成的质粒混合物；
[0044]VKORClCl173T阳性对照品3,其为插有沈QIDNO. 11所示核巧酸序列的 VK0RC1C1173T突变纯合子质粒；
[0045] 其中，质粒载体为PMD18-T质粒；所述VKORClG1639A阳性对照品2中所述VKORCl G1639A突变纯合子质粒和所述VKORClG1639A野生纯合子质粒的数量比为1:1;所述 VKORClC1173T阳性对照品2中所述VKORClC1173T突变纯合子质粒和所述VKORClC1173T 野生纯合子质粒的数量比为1:1。
[0046] 在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：质控品 (controloligo)和空白对照品，所述质控品的序列为：TAYGGTTTGCA(SEQIDNO. 7);所 述空白对照品为水；质控品的序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核巧酸链，用于检测 PyroMarkQ24测序仪的各项性能指标。
[0047] 所述的PCR反应液1和PCR反应液2中其他组分为常规的IOxPCRBuffer、dNTPS 和&0,各组分按常规体积比配置（lOxPCRBuffer、dNTPs、肥0和反应液中引物的体积比 为 5:3:37.45:1)。
[0048] 所述试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦憐酸测序的常规试剂，如由DNA聚 合酶、=憐酸腺巧硫酸化酶、巧光素酶和双憐酸酶组成的酶混合物，由5' -憐酷硫酸和巧光 素组成的底物混合物，尿喀晚DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。
[0049] 本发明还提供了如上所述的引物对在制备用于检测VKORCl基因分型的试剂中的 应用。
[0050] 本发明还提供了如上所述的试剂盒在制备用于检测VKORCl基因分型的试剂中的 应用。
[0051] 相较于现有技术，本发明提供的焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的引物对及 试剂盒具有W下有益效果：
[0052] -、通过利用焦憐酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测VKORCl基因分型时，具有定性准确，灵敏度高及特异性强的优 点；此外，还具有样品处理简单、测序步骤简单、测序速度快、半个小时完成一次上机反应、 直接给出检测位点频率分析及结果直观的优点；
[0053] 二、通过利用焦憐酸测序法技术设计了灵敏度高和特异性好的引物对及其试剂 盒，使得所述试剂盒在检测VKORCl基因分型时，可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产 物简单处理即可上焦憐酸测序仪测序、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛 细管电泳测序法灵敏度更高，更适合用于临床检验的要求；
[0054]=、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品、阳性对照品和质控品，使得所述试剂 盒在检测VKORCl基因分型时，可W更好的确保检测结果的准确性。
【附图说明】
[005引图1为临床样品VKORCl G1639A野生型的焦憐酸测序图；
[0056] 图2为临床样品VKORCl G1639A突变杂合型的焦憐酸测序图；
[0057] 图3为临床样品VKORCl G1639A突变纯合型的焦憐酸测序图；
[0058] 图4为临床VKORCl G1639A空白对照品的焦憐酸测序图；
[0059] 图5为临床样品VKORCl C1173T野生型的焦憐酸测序图；
[0060] 图6为临床样品VKORCl C1173T突变杂合型的焦憐酸测序图；
[006。图7为临床样品VKORCl C1173T突变纯合型的焦憐酸测序图；
[006引图8为临床VKORCl C1173T空白对照品的焦憐酸测序图；
[0063] 图9为临床质控品control oligo的焦憐酸测序图；
[0064] 图10至图11为VKORCl G1639A多组设计引物的焦憐酸测序图；其中图