一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法。
【背景技术】
[0002]内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPC)又称为血管母细胞(ang1blasts)，是一类能增殖并分化为血管内皮细胞(Endothelial Cells，EC)的前体细胞。EPC在机体内参与血管新生和血管形成过程，在修复心肌梗死、皮肤损伤和治疗缺血性疾病、血管组织工程及肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。
[0003]EPC在细胞分化不同阶段具有不同的亚型，一般将EPC分为早期EPC (包括CFU-EC、CAC)和晚期EPC(即内皮克隆形成细胞，缩写为ECFC)，文献提供了不同EPC亚型的鉴定方法[1.Jin Hur et al, Characterizat1n of Two Types of Endothelial ProgenitorCells and Their Different Contribut1ns to NeovasculogenesisjArter1sclerThromb Vasc B1l，2004，24:P288_293.和 2.DN Prater et al, Working hypothesis toredefine endothelial progenitor cells，Leukemia，2007，21:P1141 - 1149.】，其中，早期EPC形态为梭型，不能长期传代；ECFC呈现铺路石样形态，可以长期传代，增殖能力更强，能在体内形成血管结构。
[0004]EPC主要是从骨髓，外周血，脐血和脐静脉血管中分离培养获得，但存在操作复杂、来源有限、成本高等问题；脂肪组织具有取材方便、对供体创伤小等特点，尤其是可以直接利用美容手术后的抽脂废物，成本低且获取量大，因此，脂肪组织是分离获取EPC的理想组织来源。
[0005]现有文献报道的从人脂肪组织中获取EPC得到的均为早期EPC，例如公告号为CN1932010B的专利公开了一种分离人脂肪组织中EPC的方法，该方法得到的EPC呈梭型，为早期EPC。目前还没有从人脂肪组织中分离获取ECFC的报道，从脂肪组织中分离得到增殖能力强的ECFC具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种从脂肪组织中分离得到内皮克隆形成细胞的方法。
[0007]本发明提供了一种从人脂肪组织中分离培养内皮克隆形成细胞的方法，它包括如下步骤:
[0008]a、取脂肪组织，洗涤，消化，离心，得细胞沉淀；
[0009]b、清洗步骤a的细胞沉淀，置于含10% FBS的细胞培养基中，培养48小时；
[0010]C、将步骤b中含10% FBS的细胞培养基更换为EGM2培养基，培养至铺路石样细胞克隆团出现，培养期间每2-3天换液；
[0011]d、将EGM2培养基更换为混合培养基，每2天换液，直至细胞汇合度达到80_90%，即可；
[0012]其中，混合培养基由等体积的EGM2培养基与含10 % FBS的细胞培养基组成。
[0013]细胞克隆团是指由一个细胞分裂增殖得到的细胞数量在50个以上的细胞群体。
[0014]其中，步骤a中，所述洗涤采用的方法为:加入PBS或生理盐水，振荡I分钟，静置至脂肪组织与液体自然分层，保留上层脂肪组织。
[0015]其中，步骤a中，所述洗涤的次数为2-3次。
[0016]其中，，步骤a中，所述消化的步骤为:对洗涤后的脂肪组织加入等体积胶原酶溶液，37°C摇床下，摇速为150rpm/min，消化0.5-2小时；
[0017]其中，所述胶原酶溶液为质量分数为0.1-0.5%的I型胶原酶溶液；或为胶原酶与胰蛋白酶的混合溶液，混合溶液中I型胶原酶质量分数为0.2%，胰胰蛋白酶质量分数为0.05% ；
[0018]步骤a中，所述离心的条件为??离心力为500_900g，离心时间为5_10分钟。
[0019]进一步地，所述胶原酶溶液为质量分数为0.2%的I型胶原酶溶液；
[0020]所述离心的条件为:离心力为900g，离心时间为5分钟。
[0021]其中，步骤b中，所述清洗采用的方法为:用生理盐水重悬细胞，离心，保留沉淀。
[0022]进一步地，所述离心的条件为??离心力为500g，离心时间为5分钟。
[0023]其中，步骤b和/或d中，所述细胞培养基为DMEM/F12。
[0024]DMEM/F12，即 DMEM:F12(1:1)。
[0025]其中，步骤b中，所述培养是在培养瓶中进行，培养瓶预先用I型鼠尾胶原铺板。
[0026]进一步地，所述培养瓶为T75培养瓶，所述I型鼠尾胶原铺板的浓度为每平方厘米培养表面IygI型鼠尾胶原。
[0027]本发明还提供了上述方法制备得到的内皮克隆形成细胞。
[0028]本发明提供的分离培养方法，可以从脂肪组织中高效获得内皮克隆形成细胞(ECFC)，得到的细胞通过形态学观察和功能鉴定可知，细胞具有典型的铺路石样细胞形态、低密度脂蛋白内吞实验呈阳性、裸鼠体内证实有良好的成血管能力，成血管能力强，增殖能力强。应用本发明提供的分离方法，可以从脂肪组织中高效的获得ECFC ;而且本发明方法操作简单、分离培养时间短，具有良好的应用前景。
[0029]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0030]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0031]图1 ECFC消化接种培养，倒置显微镜下观察，
[0032]A.第3天，看到小的铺路石样形态的细胞克隆第6天，可以看到大的铺路石样形态的细胞克隆；(:和D.第10天，细胞汇合度达到80%。
[0033]图2 ECFC的表面markers流式检测结果，F.不同代次ECFC的CD34和VEGFR2表达情况。
[0034]图3 ECFC内吞LDL实验，荧光显微镜观察，
[0035]A.DAPI标记显示蓝色荧光的细胞核；B.Dil-Ac标记的LDL被ECFC内吞后，分解出的Dil-Ac显示红色荧光；C.图片A和B融合。
[0036]图4 ECFC的血管形成实验，
[0037]A.ECFC铺在Matrigel上2小时后开始形成管状结构ECFC铺在Matrigel上4小时后成网状结构；C.ECFC在I型鼠尾胶原上培养形成血管。
[0038]图5 ECFC和ASC裸鼠皮下包埋实验结果，左侧为包埋7天后取出的组织；右侧为包埋组织切片后H&E染色结果。
[0039]图6 ECFC的连续传代，ECFC连续传至PlO代，横轴为代次，数轴为相应代次收获时累计细胞收获量(单位:个)。
【具体实施方式】
[0040]下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0041]本发明所用的试剂、仪器如下:
[0042]磷酸盐缓冲液:PBS pH = 7.4，GIBC0，美国；
[0043]I型胶原酶、胰蛋白酶、DMEM:F12(1:1):GIBC0，美国；
[0044]EGM2 培养基:LONZA，瑞士 ；
[0045]莱卡DMI3000B莱卡倒置显微镜，德国。
[0046]实施例1本发明内皮克隆形成细胞的分离培养
[0047]a、取脂肪组织，用生理盐水洗涤脂肪组织2遍后，去除下层液体，保留上层脂肪；
[0048]加入等体积的质量分数为0.2%的I型胶原酶溶液，在37°C摇床中消化I小时，振荡频率150rpm/min ;放入离心机中，离心力900g，离心5分钟，弃上清，得细胞沉淀；
[0049]b、对步骤a的细胞沉淀，加入生理盐水，重悬细胞团，离心力500g，离心5分钟；
[0050]弃上清，沉淀用含10%?83的01^1^12(1:1)重悬，接种于0.lmg/ImL I型鼠尾胶原预铺的T75培养瓶中，培养48小时；
[0051]C、将步骤b中含10% FBS的细胞培养基更换为EGM2培养基，培养I天，显微镜下可见铺路石样细胞克隆团出现；
[0052]d、将EGM2培养基更换为混合培养基，培养，每2天换液，每次换液时将培养皿置于显微镜下观察，直至ECFC汇合度达到80-90%，即可；
[0053]其中，混合培养基由等体积的EGM2培养基与含10% FBS的DMEM/F12培养基组成。
[0054]实施例2本发明内皮克隆形成细胞的分离培养
[0055]a、取脂肪组织，用生理盐水洗涤脂肪组织3遍后，去除下层液体，保留上层脂肪；
[0056]加入等体积的质量分数为0.1 %的I型胶原酶溶液，在37°C摇床中消化2小时，振荡频率150rpm/min ;放入离心机中，离心力500g，离心10分钟，弃上清，得细胞沉淀；
[0057]b、对步骤a的细胞沉淀，加入生理盐水，重悬细胞团，离心力500g，离心5分钟；
[0058]弃上清，沉淀用含10%?83的01^1^12(1:1)重悬，接种于0.lmg/ImL I型鼠尾胶原预铺的T75培养瓶中，培养48小时；
[0059]C、将步骤b中含10% FBS的细胞培养基更换为EGM2培养基，培养至显微镜下可见铺路石样细胞克隆团出现，培养期间每2-3天换液；
[0060]d、将EGM2培养基更换为混合培养基，培养，每2天换液，每次换液时将培养皿置于显微镜下观察，直至ECFC汇合度达到80-90%，即可；
[0061]其中，混合培养基由等体积的EGM2培养基与含10% FBS的DMEM/F12培养基组成。
[0062]实施例3本发明内皮克隆形成细胞的分离培养
[0063]a、取脂肪组织，用生理盐水洗涤脂肪组织2遍后，去除下层液体，保留上层脂肪；
[0064]加入等体积的质量分数为0.5%的I型胶原酶溶液，在37°C摇床中消化0.5小时，振荡频率150rpm/min ;放入离心机中，离心力900g，离心5分钟，弃上清，得细胞沉淀；
[0065]步骤b、c、d同实施例2。
[0066]实施例4本发明内皮克隆形成细胞的分离培养
[0067]a、取脂肪组织，用生理盐水洗涤脂肪组织3遍后，去除下层液体，保留上层脂肪；
[0068]加入等体积的质量分数为0.5%的I型胶原酶溶液，在37°C摇床中消化0.5小时，振荡频率150rpm/min ;放入离心机中，离心力900g，离心5分钟，弃上清，得细胞沉淀；
[0069]b、对步骤a的细胞沉淀，加入生理盐水，重悬细胞团，离心力500g，离心5分钟；
[0070]弃上清，沉淀用含10% FBS的DMEM:F12(1:1)重悬，按每5_10mL脂肪接种一个1